3. Použité chemikálie
Všechny použité chemikálie musí být čistoty p. a. nebo vyšší
3.1 Ethanol, bezvodý
3.2 Aceton
3.3 Ethanol, 96 % (V/V)
3.4 Roztok amoniaku, 25 %
20
(d = 0,91)
4
3.5 L-(+)-askorbová kyselina
3.6 Chloroform
3.7 Cyklohexan
3.8 Dusík, technický
3.9 Toluen
3.10 Benzen
3.11 Butan-l-ol
3.12 Butan-2-ol
3.13 Kyselina fosforná, 50 % roztok (V/V)
3.14 Diazotační činidlo. Buď:
- 3-nitro-1-benzendiazonium-chlorbenzensulfonát (ve formě stabilní soli), jako např. v červeni 2 JN - Francolor,
- 2-chlor-4-nitro-1-benzendiazonium-naftalenbenzoát (ve formě stabilní soli), jako např. v činidle NNCD - referenční č. 74 150 FLUKA,
nebo ekvivalentní.
3.15 Dusičnan stříbrný
3.16 p-dimethylaminobenzaldehyd
3.17 2,5-dimethylfenol
3.18 Chlorid železitý, hexahydrát
3.19 Kyselina chlorovodíková, 10 % roztok (m/V)
3.20 Standardy
Standardy jsou sloučeniny uvedené v oddíle 1 "Rozsah a oblast použití". V případě aminosloučenin musí být standardní sloučenina buď ve formě hydrochloridu (mono nebo di), nebo jako volná báze.
3.21 Standardní roztoky 0,5 % (m/V)
Připraví se 0,5 % roztoky (m/V) standardů uvedených v bodě 3.20.
Naváží se 50 ± 1 mg standardu do odměrné baňky na 10 ml.
Přidá se 5 ml 96 % ethanolu (3.3) a 250 ml kyseliny askorbové (3.5).
Roztok se alkalizuje přidáním roztoku amoniaku (3.4) na hodnotu pH 10 (zjišťuje se indikátorovým papírkem).
Doplní se na 10 ml 96 % ethanolem (3.3) a promíchá.
Roztoky je možno uchovávat po dobu jednoho týdne v chladu a temnu.
V některých případech může po přidání askorbové kyseliny a roztoku amoniaku vzniknout sraženina. Před dalším postupem je třeba ji nechat usadit.
3.22 mobilní fáze
3.22.1 Aceton - chloroform - toluen (35 : 25 : 40, V/V/V)
3.22.2 Chloroform - cyklohexan - ethanol - 25 % roztok amoniaku (80 : 10 : 10 : 1, V/V/V/V)
3.22.3 Benzen - butan-2-ol - voda (50 : 25 : 25 , V/V/V). Důkladně se protřepe a po dekantaci při pokojové teplotě (20 až 25 °C) se k vyvíjení použije horní fáze.
3.22.4 n-butanol - chloroform - činidlo M (7 : 70 : 23, V/V/V). Fáze se pečlivě dekantují při pokojové teplotě (20 až 25 °C) a použije se spodní fáze.
Příprava činidla M
Roztok amoniaku, 25 % (V/V) 24 objemových jednotek
Kyselina fosforná, 50 % (3.13) 1 objemová jednotka
Voda 75 objemových jednotek
Poznámka:
Mobilní fáze obsahující amoniak je třeba bezprostředně před použitím dobře protřepat.
3.23 Detekční činidla
3.23.1 Diazotační činidlo
Připraví se 5 % (m/V) vodný roztok zvoleného činidla (3.14). Tento roztok se musí připravit bezprostředně před použitím.
3.23.2 Ehrlichovo činidlo
2 g p-dimethylaminobenzaldehydu (3.16) se rozpustí ve 100 ml 10 % vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (m/V) (3.19).
3.23.3 2,5-dimethylfenol - hexahydrát chloridu železitého
Roztok 1: Rozpustí se 1 g dimethylfenolu (3.17) ve 100 ml 96 % ethanolu (3.3).
Roztok 2: Rozpustí se 4 g hexahydrátu chloridu železitého (3.18) ve 100 ml 96 % ethanolu (3.3).
Při vyvolání chromatogramu se těmito roztoky provádí postřik samostatně, nejprve roztokem 1, poté roztokem 2.
3.23.4 Amoniakální dusičnan stříbrný
25 % amoniak (3.4) se přidává k 5 % (m/V) vodnému roztoku dusičnanu stříbrného (3.15), až se sraženina právě rozpustí. Toto reakční činidlo se připravuje bezprostředně před použitím. Nelze jej uchovávat.