Příloha č. 23 část II
Biologické zkoušení určitých proteinových krmiv
Biologické zkoušení určitých proteinových krmiv zahrnuje provedení zkoušek uvedených v této příloze.
Zpracovaná dokumentace o výsledcích těchto zkoušek musí obsahovat přesné údaje, které musí být v předepsaném pořadí dle této přílohy očíslovány, a musí k nim být přiložen souhrn. Neuvedení některé zkoušky je nutno zdůvodnit. Publikace, na něž je odkazováno, je nutno doložit v předkládané dokumentaci. Ústav si může dodatečně vyžádat další podklady.
V této příloze se pojem produkt vztahuje na jakýkoli proteinový produkt ve stavu, v jakém by měl být použit jako samostatná surovina nebo jako součást krmiva.
Každá změna výrobního postupu produktu nebo každá změna jako použití podléhá ohlášení, na jehož základě může ústav požadovat předložení podkladů, které umožní nové posouzení.
1. Údaje o použitém mikroorganismu
1.1. Taxonomie, původ, morfologie, biologické vlastnosti, v daném případě genetické změny
1.2. Neškodnost, případná stálost mimo kultivační medium a případné účinky na životní prostředí
1.3. Stálost a stupeň čistoty kultivovaných kmenů mikroorganismů. Metody použitelné k ověření těchto znaků.
2. Kultivační media a výrobní postup
2.1. Složení substrátů, přidávaných látek atp.
2.2. Postupy výroby, sušení a čištění. Postup devitalisace mikroorganismů. Metody použitelné k ověření stálosti složení krmiva vyrobeného kultivací mikroorganismů a ke stanovení případných chemických, fyzikálních nebo biologických nečistot v průběhu výroby
2.3. Technický postup úpravy pro použití.
3. Znaky produktu
3.1. Fyzikální a fyzikálně-chemické vlastnosti:
makro- a mikroskopické morfologie, velikost částic, hustota, specifická hmotnost, vazba vody, rozpustnost, elektrostatické vlastnosti atd.
3.2. Chemické složení a znaky
3.2.1. Vlhkost, obsah dusíkatých látek, tuku, vlákniny, popela, veškerých cukrů jako sacharosa. Kolísání rozpětí obsahů.
3.2.2. Obsah celkového dusíku, bílkovin, nukleových kyselin, amoniakálního dusíku, aminového dusíku, nitrátů a nitritů. Kvalitativní a kvantitativní složení aminokyselin celkem a volných aminokyselin a rovněž purinových a pyrimidinových bází.
3.2.3. Kvalitativní a kvantitativní složení tuků (mastné kyseliny, nezmýdelnitelné látky, pigmenty rozpustné v tuku, fosfolipidy).
3.2.4. Složení obsažených cukrů
3.2.5. Kvalitativní a kvantitativní složení obsahu minerálních složek.
3.2.6. Kvalitativní a kvantitativní složení obsahu vitamínů.
3.2.7. Kvalitativní a kvantitativní složení obsahu specielních složek: doplňkové látky, zbytky substrátů a zřeďovacích prostředků, jiné případně škodlivé zbytky látkové přeměny substrátu, kultivačního media, výrobního postupu.
3.3. Mikrobiologická kontaminace výrobku.
3.4. Chování a stabilita produktu ve směsi s jinými krmivy při skladování.
4. Úprava a podmínky pro použití
4.1. Navržený název produktu pro uvádění do oběhu
4.2. Úprava produktu navrhovaná pro uvádění do oběhu
4.3. Předpokládané užití produktu ve výživě zvířat. Navržené koncentrace v kompletní krmné směsi a navržené množství krmiva v denní krmné dávce pro uvažované druhy a kategorie zvířat.
5. Kontrolní metody
Kvalitativní a kvantitativní analytické metody ke kontrole produktu v kompletních krmných směsích a premixech.
Popis těchto metod musí být doplněn následujícími údaji:
zvláštnost, citlivost, hranice důkazu, rozpětí chyby a případné interference s jinými látkami. Vzorky výrobku v různých předpokládaných úpravách musí být k dispozici.
6. Ověření výživářsko-fyziologických vlastností výrobku
6.1. Určení hodnoty bílkoviny
6.1.1. Chemické, biochemické a mikrobiologické zkoušky.
6.1.2. Zkoušky produktu na laboratorních zvířatech ve srovnání s kontrolní bílkovinou.
6.2. Zkoušky produktu provedené na druzích a kategoriích zvířat, pro něž je určen jako krmivo.
Na každém druhu a kategorii zvířat, u něhož je předpoklad užití produktu, musí být provedeny následující zkoušky ve srovnání s kontrolní skupinou, která je krmena obvyklým krmivem s ekvivalentním podílem dusíkatých látek bílkovinné povahy - u přežvýkavců ekvivalentním podílem celkového dusíku za naprosto stejných podmínek výživářsko-fyziologické srovnatelnosti.
6.2.1. Stanovení hodnoty bílkovin a hodnoty energie přidávaného produktu v krmné dávce v navržených podmínkách použití a v různých fyziologických obdobích zvířat (např. růst, březost, snáška).
6.2.2. Stanovení vlivu produktu na růst (přírůstky), produkční účinnost, zdravotní stav, případné úhyny v navržených podmínkách užití.
6.2.3. Stanovení optimálního podílu produktu v krmné dávce.
6.2.4. Ověření působení produktu za navržených podmínek užití na technologické, organoleptické a ostatní kvalitativní vlastnosti živočišných produktů.
6.3. Pokusné podmínky pro zkoušení produktu na použitelnost u předpokládaných druhů a kategorií zvířat. Provedené pokusy je nutno zevrubně popsat s uvedením následujících podrobností.
6.3.1. Druh, plemeno, stáří a pohlaví zvířat a označení.
6.3.2. Počet pokusných a kontrolních skupin; počet zvířat v každé skupině (tento počet musí být dostatečný pro statistické vyhodnocení při použití vhodných statistických parametrů).
6.3.3. Procentický podíl produktu v krmné dávce, kvalitativní a kvantitativní složení krmné dávky a její analýza.
6.3.4. Místo pokusů, fyziologický a zdravotní stav zvířat a podmínky chovu podle obecně prováděné praxe.
6.3.5. Přesná doba trvání pokusů a datum zkoušek.
6.3.6. Vedlejší účinky v průběhu pokusů a časové označení jejich projevu.
7. Ověření biologických vlivů použití produktu ve výživě zvířat
7.1. Ověření na kategoriích zvířat, která přicházejí v úvahu pro užití krmiva.
Na každém druhu a kategorii zvířat, u něhož je předpoklad užití krmiva, se provádějí dále uvedené zkoušky ve srovnání s kontrolní skupinou, která je krmena obvyklým krmivem s ekvivalentním podílem dusíkatých látek bílkovinné povahy, u přežvýkavců ekvivalentním podílem celkového dusíku, za naprosto stejných srovnatelných výživářských a fyziologických podmínek.
7.1.1. Stanovení nejvyššího možného podílu produktu v denní krmné dávce bez projevu vedlejších účinků.
7.1.2. Stanovení možných účinků produktu na plodnost a provedení generačních pokusů, pokud je pro jejich provedení důvod.
7.1.3. Stanovení účinků v navržených praktických podmínkách použití na mikroorganismy trávicího traktu, vliv na přítomnost pathogenních mikroorganismů v trávicím traktu.
7.1.4. Stanovení možných reziduí produktu (substrátu, kultivačního media, rozpouštědel, kontaminantů) za navržených podmínek užití v živočišných produktech.
7.1.5. Stanovení možných reziduí produktu (substrátu, kultivačního media, rozpouštědel, kontaminantů) za navržených podmínek užití v exkrementech.
7.2. Ověření produktu na laboratorních zvířatech.
7.2.1. Chování produktu v organismu, sledování metabolismu, tj. (absorpce, akumulace, biologická přeměna, vylučování atd.).
7.2.2. Ověření možné mutagenity vyvolané kontaminanty (zejména mykotoxiny a bakteriemi) nebo rezidui produktu (substrátu, kultivačního media, rozpouštědla), včetně pokusů in vitro s aktivací výměny látkové.
7.2.3. Toxikologické zkoušky.
Dále uvedené zkoušky produktu se provádějí ve srovnání s kontrolními skupinami, kterým jsou podávána obvyklá krmiva s ekvivalentními podíly dusíkatých látek bílkovinné povahy za naprosto stejných a srovnatelných výživářských a fyziologických podmínek. Zjištěné toxické účinky musí být prozkoumány, aby byla zdůvodněna jejich příčina a průběh, a aby se zejména zjistilo, zda pocházejí z výživářsko-fyziologické nevyváženosti nebo předávkování zkoušeného produktu.
7.2.3.1. Zkouška krátkodobé toxicity (minimálně 90 dní).
Všeobecně se tyto zkoušky provádějí na dvou druzích zvířat, z nichž jeden jsou hlodavci. Produkt se podává v denní dávce v minimálně dvou různých hladinách. Tyto se volí tak, aby alespoň jedna dávka se uváděla jako bez účinku a jedna jako škodlivě se projevující. Skupiny zvířat jsou složeny z určeného počtu zvířat každého pohlaví. Vždy je zastoupena kontrolní skupina zvířat. V určených intervalech se zaznamenávají všechny rozhodující biologické údaje, zejména růstová křivka zvířat, spotřeba krmiva, hematologická vyšetření, rozbory moče, biochemické parametry, úhyny, hmotnost orgánů, symptomy patologických účinků, histologické změny nejdůležitějších orgánů a tkání. Výsledky se zevrubně doloží a vyhodnotí statisticky.
7.2.3.2. Zkoušky dlouhodobé toxicity produktu.
Všeobecně se tyto zkoušky provádějí na dvou druzích zvířat, z nichž jeden jsou hlodavci. Produkt se podává v denní dávce minimálně ve dvou různých hladinách. Pokusné období je minimálně dva roky u potkanů a nejméně 80 týdnů u myší. Skupiny zvířat jsou složeny z určeného počtu zvířat každého pohlaví. Vždy je zastoupena kontrolní skupina zvířat. V průběhu zkoušek na určení dlouhodobé toxicity v určených časových intervalech a rovněž na konci zkoušky na zvířatech, která přežila, se provádějí biologické zkoušky na stanovení krátkodobé toxicity přednostně na malé "satelitní" skupině zvířat (tj. oddělená, na hlavní skupině závislá skupina viz 7.2.3.1.).
7.2.3.3. Zkoušení karcinogenity krmiva.
U zkoušek na karcinogenitu se stanoví časový mezník prvních příznaků u pokusných zvířat, histologické typy nádorů a jejich četnost. Účinky na četnost nádorů a nebo četnost na vývoj onemocnění, které by mohly být vyvolány zkoušeným produktem, se vyhodnotí proti kontrolní skupině zvířat podle bodu 7.2.3. Výsledky je třeba zevrubně doložit a vyhodnotit statisticky.
7.2.4. Speciální zkoušky produktu v generačních pokusech.
Generační pokusy se vztahují minimálně na dvě generace zvířat v přímé linii spojeny se zkouškami na embryotoxicitu včetně teratogenity. Zvláštní pozornost se věnuje plodnosti a vrhům a jejich vývoji po narození. Lze předložit jinou metodu, která je vědecky doložena a dává měřitelné výsledky (např. Relais-toxicita).
7.2.5. Pokusné podmínky pro zkoušení produktu na laboratorních zvířatech se popisují s uvedením následujících podrobností.
7.2.5.1. Druh, plemeno a pohlaví zvířat.
7.2.5.2. Počet pokusných a kontrolních skupin, počet zvířat v každé skupině ) dostatečný počet pro statistické vyhodnocení při použití vhodných statistických parametrů).
7.2.5.3. Procentický podíl krmiva v krmné dávce, kvalitativní a kvantitativní složení krmné dávky a její analýza.
7.2.5.4. Podmínky chovu v průběhu celé doby trvání zkoušek.
7.2.5.5. Přesná doba trvání zkoušek a datum zkoušek.
7.2.5.6. Příčiny a procenta úhynu v jednotlivých skupinách zvířat.
7.2.5.7. Klinické symptomy a patologické změny v průběhu zkoušek a časový mezník jejich projevu.
7.3. Ověření ve vztahu k životnímu prostředí - podle druhu zbytků produktu (substrát, kultivační médium, rozpouštědla, kontaminanty) ve výkalech krmených zvířat se požadují údaje o přetrvání těchto reziduí v hnoji, půdě a vodě, a o jejich účincích na půdní biologii, rostlinná společenstva a život ve vodě.
8. Speciální účelová vyšetření
Podle druhu a podmínek použití produktu se požadují údaje o alergii, zánětech kůže, dráždění očních sliznic, dýchacích nebo trávicích cest a za účelem stanovení možných rizik při zacházení s produktem a pro zajištění preventivních opatření.
------------------------------------------------------------------