ČÁST IV
Postup titrace pro ověření vnímavosti buněčných kultur k infekcím
Doporučené postupy pro titraci podle části I odd. III. odst. 3:
Je nutno použít nejméně dva izoláty viru VHS a jeden izolát viru IHN. Izoláty by měly reprezentovat nejdůležitější skupinu virů v EU. Např. v případě viru VHS je nutno vybrat jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u pstruha duhového žijícího ve sladké vodě a jeden patogenní izolát viru, který se vyskytuje u kambaly velké žijící ve slané vodě, a v případě viru IHN je nutno vybrat jeden patogenní evropský kmen viru z pstruha duhového. Měly by být použity definované izoláty pocházející z členských států. Referenční laboratoř Společenství pro nákazy ryb může dát k dispozici referenční izoláty.
Šarže virů se získávají z několika málo pasáží buněčných kultur (buněčné linie BF-2 nebo RTG-2 v případě viru VHS a buněčné linie EPC nebo FHM v případě viru IHN), které jsou kultivovány v kultivačních lahvích pro buněčné kultury. Je nutno použít médium buněčných kultur s minimálně 10 % séra. Pro inokulaci použijte nízký poměr infekčních virových partikulí k počtu buněk v kultuře (< 1).
Pokud je CPE úplný, virus se získává odstřeďováním supernatantu buněčné kultury při 2000x g po dobu 15 min., filtruje se na membráně (0,45 μm) za sterilních podmínek a distribuuje se v označených zkumavkách, které je možno použít pro zmrazování. Virus se uchovává při teplotě - 80 °C.
Týden po zmražení se tři zkumavky s každým virem nechají rozmrazit ve studené vodě a suspenze viru se titrují a kontrolují se příslušné buněčné linie. Při podezření na sníženou vnímavost buněčných linií se každý izolát viru nechává roztát a titruje se minimálně každých šest měsíců.
Postupy titrace je nutno podrobně popsat a pokaždé provést stejným způsobem.
Titrace se zředěním až do konečného bodu by měla zahrnovat minimálně šest opakování každého kroku ředění. Výsledky dosažené touto titrační metodou se srovnají s titry předtím získanými. Pokud poklesne titr jednoho ze tří izolátů viru o faktor 2 log nebo více ve srovnání s původním titrem, neměla by buněčná linie již být použita pro výzkumné účely.
Pokud se v laboratoři používají různé buněčné linie, měla by být každá z nich vyšetřována zvlášť.
Záznamy je nutno archivovat minimálně deset let.