3. Odstřeďování homogenátu
Homogenát se odstřeďuje v chlazené odstředivce vychlazené na 2 až 5 °C při 2000 až 4000x g 15 minut, supernatant se odebere a je vystaven působení antibiotik (v této fázi se hodí např. gentamycin v koncentraci 1 mg/ml) buď po dobu čtyř hodin při 15 °C nebo přes noc při 4 °C.
Jestliže byly vzorky přepravovány v transportním médiu (tj. působila na ně antibiotika), může se ošetření supernatantu antibiotiky vynechat.
Účelem ošetření antibiotiky je, zabránit bakteriální kontaminaci vzorků; není tedy už nutné provádět filtraci přes membránové filtry.
Jestliže je odebraný supernatant uchováván při - 80 °C během 48 hodin po odebrání, může být znovu použit pro virologické vyšetření, a to pouze jednou.
Pokud se vyskytnou praktické potíže (např. porucha inkubátoru, problémy s buněčnými kulturami atd.), které znemožňují inokulovat buňky během 48 hodin po odběru vzorků tkání, je možné supernatant zmrazit při - 80 °C a provést virologické vyšetření během 14 dnů.
Před inokulací buněk se supernatant smísí ve stejném poměru s přiměřeně zředěnou předem připravenou směsí antisér, obsahující protilátky proti domácím sérotypům IPN, a je inkubován minimálně hodinu při 15 °C nebo maximálně 18 hodin při 4 °C. Antisérum musí mít v plakovém neutralizačním testu při 50 % neutralizaci titr nejméně 1:2 000.
Ošetření všech inokul antisérem proti viru IPN (viru, který je v některých oblastech Evropy přítomen v 50 % rybích vzorků) má za úkol zabránit vytvoření CPE, vyvolaného virem IPN v inokulovaných buněčných kulturách. To vede ke zkrácení doby virologického vyšetření, jakož i ke snížení počtu případů, při kterých by výskyt CPE mohl být považován za potenciální znamení VHS nebo IHN.
Pokud vzorky pocházejí z výrobních jednotek považovaných za prosté IPN, může být ošetření inokula antisérem s protilátkami proti viru IPN vynecháno.