3. Imunofluorescence (IF)
Pro každý izolát viru, který je potřeba určit, se buňky nasadí nejméně na osm krycích sklíček v takové hustotě, která umožňuje vznik přibližně 60 % až 90 % monolayeru po 24 hodinách kultivace. Pro tento účel se doporučují buňky EPC z toho důvodu, že pevně přilnou k povrchu sklíček, ale mohou být použity také jiné buněčné linie, jako např. BF-2, RTG-2 nebo FHM.
Jakmile se buňky přichytí k povrchu sklíček, (asi za hodinu po nasazení), nebo maximálně po 24hodinové inkubaci kultur, inokuluje se virus, který má být identifikován. Inokulují se čtyři kultury v objemovém poměru 1:10 a čtyři další kultury v objemovém poměru 1:1000. Ty jsou pak inkubovány 20 - 30 hodin při 15 °C.
Po inkubaci se kultury oplachují dvakrát Eagleho MEM bez séra, fixují se 80 % ledovým acetonem a barví se metodou IFAT ve dvou stupních. První stupeň sestává z reakce poly- či monoklonálních protilátek referenční kvality. Druhý stupeň je reakce antiséra, konjugovaného s fluorochrómem, proti imunoglobulinu, použitému v prvním stupni. Pro každé z vyšetřovaných antisér je nutno obarvit minimálně jednu kulturu inokulovanou vysokou dávkou a jednu nízkou dávkou. Při vyšetření je rovněž nezbytné provést vhodné negativní a pozitivní kontroly. K tomu se doporučují fluorochrómy jako FITC nebo TRITC.
Z obarvených kultur se zhotoví nativní preparáty za použití fyziologického roztoku glycerolu a vyšetřují se v dopadajícím UV světle. K tomu účelu je nutno použít okulár zvětšující 10x a objektiv zvětšujících 25x s numerickou aperturou > 0,7 nebo okulár zvětšující 12x a objektiv zvětšující 40x s numerickou aperturou > 1,3.
Výše popsaná metoda IF je uvedena jako příklad. Alternativně (vzhledem k buněčným kulturám, fixaci a protilátkám referenční kvality) mohou být použity jiné metody IF s prokázanou účinností.