2.1 Normy pro bovinní a aviární tuberkulín
2.1.1 Definice
Tuberkulín PPD, bovinní nebo aviární, je preparát získaný z teplem ošetřených produktů růstu a rozkladu Mycobacterium bovis nebo Mycobacterium avium (podle potřeby), které jsou schopny odhalit pozdní alergickou reakci u zvířete senzibilizováného k mikroorganismům stejného druhu.
2.1.2 Výroba
Získává se z frakcí rozpustných ve vodě, připravených záhřevem ve volně proudící páře a následně filtrováním kultur M. bovis nebo M. avium (podle potřeby) vyrostlých v tekuté syntetické půdě. Aktivní frakce filtrátu, skládající se hlavně z proteinu, se izoluje srážením, promyje se a znovu rozpustí. Může se přidat antimikrobiální konzervační prostředek, který nezpůsobuje falešné pozitivní reakce, jako je fenol. Konečný sterilní preparát, prostý mykobakterií, se asepticky přenese do sterilních kontejnerů ze skla odolného proti poškození, které se poté uzavřou tak, aby se zabránilo kontaminaci. Přípravek lze lyofilizovat.
2.1.3 Zkouška výrobku
Injekčně se aplikují řady po sobě jdoucích ředění intradermálně na různá místa přiměřeně senzibilizovaným morčatům albínům, z nichž každé váží nejméně 250 g. Po 24 až 28 hodinách se objeví reakce ve formě edémů se zarudnutím kůže, též s nekrózou nebo bez nekrózy v místech vpichu. Velikost a síla reakcí jsou různé podle dávky. Nesenzibilizovaná morčata nevykazují na podobné aplikace žádné reakce.
2.1.4 Testování
2.1.4.1 pH: pH je 6,5 až 7,5.
2.1.4.2 Fenol: Jestliže preparát k vyšetření obsahuje fenol, jeho koncentrace není vyšší než 5 g/l.
2.1.4.3 Senzibilizační účinek: použije se skupina tří morčat, která nebyla ošetřena žádným materiálem, jenž by zkresloval výsledky vyšetření. Třikrát v intervalech pěti dní se injekčně intradermálně aplikuje každému morčeti dávka testovaného preparátu, která odpovídá 500 MJ v 0,1 ml. 15 až 21 dní po třetí injekci se aplikuje stejná dávka, tj. 500 MJ, intradermálně těmto zvířatům a kontrolní skupině tří morčat stejné hmotnosti, která předtím nedostávala injekce tuberkulínu. Za 24 až 28 hodin po posledních aplikacích by se reakce těchto dvou skupin neměly nijak významně lišit.
2.1.4.4 Toxicita: použijí se dvě morčata, z nichž každé váží alespoň 250 g, kterým nebyl podán žádný materiál, jenž by zkresloval výsledky vyšetření. Podkožně se každému morčeti aplikuje 0,5 ml testovaného preparátu. Zvířata se sledují po dobu sedmi dnů. Během doby sledování by se neměly vyskytnout žádné abnormální účinky.
2.1.4.5 Sterilita: shoduje se s testem sterility, který je předepsaný v monografii o Očkovacích látkách k veterinárnímu použití, 4. vydání Evropského lékopisu 2002.
2.1.5 Účinnost
Účinnost tuberkulínu PPD, bovinního nebo aviárního, se určuje srovnáním reakcí senzibilizovaných morčat po intradermálních injekcích řady roztoků testovaného preparátu s reakcemi vzniklými na základě podání známých koncentrací referenčního preparátu tuberkulínu PPD, bovinního nebo aviárního (podle potřeby), kalibrovaného v mezinárodních jednotkách.
Za účelem testování účinnosti se senzibilizuje alespoň devět morčat albínů, z nichž každé váží 400 až 600 g, a to intramuskulární injekcí 0,0001 mg vlhké hmoty živého kmene M. bovis AN5 rozptýleného v 0,5 ml 9 g/l roztoku chloridu sodného R u bovinního tuberkulínu nebo přiměřenou dávkou inaktivovaného nebo živého M. avium u aviárního tuberkulínu hluboko do svalu. Nejdříve za čtyři týdny po senzibilizování morčat se jejich boky oholí, aby bylo připraveno místo pro maximálně čtyři místa vpichu na každé straně. Připraví se ředění testovaného preparátu a referenčního preparátu v izotonickém fyziologickém roztoku ve fosfátovém pufru (pH 6,5-7,5) s obsahem 0,005 g/l polysorbátu 80 R. Použijí se minimálně tři dávky referenčního preparátu a minimálně tři dávky testovaného preparátu. Dávky se zvolí tak, aby vzniklé změny měly v průměru alespoň 8 mm a maximálně 25 mm. Ředění se rozdělí nahodile na místa s použitím latinského čtvercového rozdělení. Každá dávka se vstříkne intradermálně ve stálém objemu 0,1 až 0,2 ml. Průměry změn se změří po 24 až 28 hodinách a vypočítá se výsledek testu za použití obvyklých statistických metod a za předpokladu, že průměry změn jsou přímo úměrné logaritmu koncentrace tuberkulínu.
Test je platný pouze pokud předpokládané limity chyby (P = 0,95) jsou v rozmezí 50 % až 200 % odhadované účinnosti. U bovinního tuberkulínu by odhadovaná účinnost neměla být menší než 66 % a větší než 150 % stanovené účinnosti. U aviárního tuberkulínu by odhadovaná účinnost neměla být menší než 75 % a větší než 133 % stanovené účinnosti. U obou tuberkulínu, bovinního i aviárního, by stanovená účinnost by neměla být menší než 20 000 MJ/ml.
2.1.6 Skladování
Skladujte při teplotě 5 ± 3 °C a chraňte před světlem.
2.1.7 Označování
Označení uvádí:
- účinnost v mezinárodních jednotkách na mililitr,
- název a množství všech přidaných látek,
- u lyofilizovaných přípravků:
- název a objem rozpouštědla, které se má přidat,
- že výrobek má být použit ihned po rozpuštění.