VII.2 Popis metody
VII.2.1 Přístroje
a) automatický elektrolytický měřič BSK nebo respirometr vybavený 6 baňkami, každá objemu 300 ml s uzávěry, které umožňují absorbci CO2,
b) místnost s konstantní teplotou nebo vodní lázeň s teplotou 25 ± 1 °C,
c) zařízení pro filtraci s membránovými filtry (nepovinně),
d) analyzátor CO2 (nepovinně)
VII.2.2 Příprava minerálního média
Vždy 3 ml dále uvedených roztoků a, b, c a d se doplní deionizovanou vodou na objem 1000 ml.
a) Hydrogenfosforečnan draselný K HPO 21,75 g,
2 4
dihydrogenfosforečnan draselný KH PO 8,50 g,
2 4
dodekahydrát hydrogenfosforečnanu sodného
Na HPO . 12 H O 44,60 g,
2 4 2
chlorid amonný NH Cl 1,70 g
4
se rozpustí v 1000 ml vody. Hodnota pH by měla být 7,2.
b) Heptahydrát síranu hořečnatého MgSO . 7 H O 22,50 g
4 2
se rozpustí v 1000 ml vody.
c) Chlorid vápenatý CaCl 27,50 g
2
se rozpustí v 1000 ml vody.
d) hexahydrát chloridu železitého FeCl . 6H O 0,25 g
3 2
se rozpustí v 1000 ml vody.
VII.2.3 Příprava inokula
Odeberou se vzorky z nejméně deseti lokalit, kde se používají a vypouštějí různé chemikálie. Z míst jako jsou čistírny městských a průmyslových odpadních vod, řek, jezer a moří se odebírá 1 litr kalu, povrchových půd, vody aj., které se pečlivě smíchají. Po odstranění vyflotovaných látek a odsátí se pH supernatantu upraví na 7 ± 1 hydroxidem sodným nebo kyselinou fosforečnou. Do práce se bere vhodný objem tohoto filtrovaného supernatantu a naplní se jím nádoba, která se 23,5 h provzdušňuje. Třicet minut po ukončení provzdušňování se odlije 1/3 objemu a doplní stejným objemem roztoku, který obsahuje vždy po 0,1 % glukosy, peptonu a hydrogenfosforečnanu draselného a obnoví se provzdušňování. Tento postup se opakuje jednou denně. Kalová jednotka musí být provozovaná podle zásad dobré laboratorní praxe: odtok musí být čirý, teplota musí být udržovaná při 25 ± 2 °C, pH má být 7 ± 1, kal má dobře sedimentovat, provzdušňování musí být dostatečné za všech okolností, mají být přítomni provoci a aktivita kalu se má kontrolovat pomocí referenční látky nejméně každé 3 měsíce. Takto získané inokulum se nepoužívá dříve než po 1 měsíci kultivace a déle než po čtyřech měsících. Proto je nutné odebírat vzorky ze zvolených 10 míst každé 3 měsíce.
K udržení stejné aktivity čerstvého a starého kalu se filtrovaný supernatant starého kalu smíchává se stejným objemem nového kalu a směs se kultivuje podle popsaného postupu. Do práce se kal bere 18 - 24 h po přídavku živin.
VII.2.4 Příprava baněk
Připravuje se 6 baněk podle schematu:
-1
č. 1 zkoušená látka ve zřeďovací vodě 100 mg.l
-1
č. 2, 3, 4 zkoušená látka v minerálním médiu 100 mg.l
-1
č. 5 referenční látka (např. anilin) v minerálním médiu 100 mg.l
č. 6 minerální médium
Málo rozpustné látky se přidávají přímo odvážením nebo odměřením objemu nebo se zpracují jak je uvedeno v příloze č. 3, s výjimkou těch, u kterých nemohou být použita rozpouštědla nebo emulgátory. Do speciálních uzávěrů lahví se přidá absorbent oxidu uhličitého. pH v baňkách č. 2, 3 a 4 se upraví na 7,0.
VII.2.5 Provedení zkoušky
Baňky č. 2, 3, 4 (zkušební suspenze), č. 5 (kontrola aktivity), č. 6 (slepý pokus) se inokulují malým množstvím inokula tak, aby výsledná koncentrace kalu byla 30 mg.l-1. Láhev č. 1 je bez inokula, čímž se získává abiotická kontrola. Nasadí se zátka, zkontroluje se těsnost, zapnou se míchadla a započne se s měřením úbytku kyslíku za stíněných podmínek. Denně se kontroluje teplota, míchání, zapisovač spotřeby kyslíku a zaznamenávají se všechny změny barvy obsahu láhve. Při využití 6 křivkového zapisovače se získává přímo křivka BSK. Na konci inkubace, která je obvykle 28 dní, měří se pH v láhvi a stanovuje zbytková koncentrace zkoušené látky a jejich metabolitů a v případě zkoušení látek rozpustných ve vodě také DOC (postup podle přílohy 2). V případě těkavých látek se používá speciální postup. V případě výskytu nitrifikace se stanovují, jestliže je to možné, dusičnany a dusitany.