Příloha 1
Příklad postupu pro kultivaci řas
Obecně
Účelem kultivace dále popsaným postupem je získání řasových kultur pro zkoušky toxicity.
Metody použité k tomuto účelu musí zaručit, aby kultury řas nebyly infikovány bakteriemi (ISO 4833).
Za určitých okolností mohou být žádoucí i axenické kultury, avšak základem jsou jednodruhové kultury.
Aby nemohlo dojít ke kontaminaci bakteriemi a jinými řasami, provádějí se všechny pracovní kroky za sterilních podmínek.
Postupy při získání řasových kultur
Příprava živných roztoků (média)
Médium může být připraveno zředěním koncentrovaných základních roztoků živin. K získání pevného média se přidává 0,8 % agaru. Použité médium by mělo být sterilní. Sterilace autoklávem může vést ke ztrátě NH3.
Kmenová kultura
Kmenové kultury jsou malé kultury řas, které se přenášejí pravidelně do čerstvého média. Slouží jako výchozí zkušební materiál. Nejsou-li kultury pravidelně používány, vyočkovávají se na šikmý agar a pak se přenášejí nejméně jednou za dva měsíce do čerstvého média.
Kmenové kultury se pěstují v Erlenmayerových baňkách obsahujících vhodné medium (přibližně objem 100 ml). Jsou-li řasy inkubovány při teplotě 20 °C a stálém osvětlení, musí se přenášet každý týden.
Při přeočkování se přenese sterilní pipetou do baňky s čerstvým mediem takové množství "staré" kultury, aby výchozí koncentrace činila u rychle rostoucího druhu řas asi 1/100 koncentrace kultury staré.
Rychlost růstu daného druhu řas lze odečíst z růstové křivky. Z této růstové křivky lze odhadnout hustotu, při níž musí být kultura přenesena do čerstvého média. K tomu musí dojít před fází odumírání kultury.
Předkultura
Účelem předkultur je poskytnout dostatečné množství řas potřebných pro naočkování zkušebních kultur. Předkultura se inkubuje za zkušebních podmínek a použije se ještě během exponenciálního růstu, to znamená obvykle po třídenní inkubační lhůtě. Obsahují-li kultury řas deformované nebo abnormální buňky, musí se vyhodit.