III.2 Popis metody
III.2.1 Aparatura
(a) Erlenmeyerovy baňky, např. od 250 ml do 2 l, podle objemu potřebného pro analýzu DOC;
(b) Třepačka - pro umístění Erlenmeyerových baněk, buď s automatickou regulací teploty nebo používaná v místnosti s konstantní teplotou, a s dostatečným výkonem pro udržení aerobních podmínek ve všech baňkách;
(c) Filtrační aparatura s vhodnými membránami;
(d) Analyzátor DOC;
(e) Přístroj pro stanovení rozpuštěného kyslíku;
(f) Odstředivka.
III.2.2 Příprava minerálního média
Příprava zásobních roztoků viz I.6.2.
Smísí se 10 ml. roztoku (a) s 80 ml zřeďovací vody, přidá se 1 ml roztoků (b) až (d) a doplní se na 1 l zřeďovací vodou.
Tato metoda používá jako inokulum pouze 0,5 ml přečištěné odpadní vody a proto je nutné médiu dodat stopové prvky a růstové faktory. Toho se dosáhne přidáním 1 ml každého z dále uvedených roztoků na 1 litr výsledného média:
Roztok stopových prvků:
Tetrahydrát síranu manganatého, MnSO .4H O 39,9 mg
4 2
Kyselina boritá, H BO 57,2 mg
3 3
Heptahydrát síranu zinečnatého, ZnSO .7H O 42,8 mg
4 2
Heptamolybdenan amonný, (NH ) Mo O 34,7 mg
4 6 7 24
Chelát Fe (FeCl s ethylendiamintetraoctovou kyselinou) 100,0 mg
3
Rozpustí se ve zřeďovací vodě a doplní se na 1000 ml.
Vitaminový roztok:
Kvasničný extrakt 15,7 mg
Kvasničný extrakt se rozpustí ve 100 ml vody. Sterilizuje se průchodem membránou 0,2 μm, nebo se připraví čerstvé.
III.2.3 Příprava a předběžná kondicionace inokula
Inokulum se získá z výstupu druhého stupně čistírny nebo laboratorní jednotky zpracovávající převážně domovní odpadní vody.
Viz I.6.4.2 a I.6.5.
III.2.4 Příprava baněk
Je například možné naplnit podíly po 800 ml minerálního média do 2 l Erlenmeyerových baněk a do jednotlivých baněk přidat dostatečná množství zásobních roztoků zkoušené a referenční látky, aby se získaly koncentrace látky odpovídající 10 - 40 mg DOC.l-1. Zkontrolují se hodnoty pH a případně se upraví na 7,4. Baňky se naočkují výtokem z druhého stupně čištění odpadních vod (viz I.6.4.2). Připraví se rovněž kontrolní pokusy s inokulem v minerálním médiu, avšak bez zkoušené nebo referenční látky.
V případě potřeby se použije jedna baňka ke kontrole možného inhibičního efektu zkoušené látky naočkováním roztoku, který v minerálním médiu obsahuje srovnatelné koncentrace jak zkoušené, tak referenční látky.
Je-li třeba, použije se rovněž další, sterilní, baňka ke kontrole, zda je zkoušená chemická látka rozkládána abioticky, pomocí roztoku dané chemické látky bez inokula (viz I.6.6).
Existuje-li důvodné podezření, že se zkoušená látka významně adsorbuje na skle, kalu apod., provede se předběžný odhad pravděpodobného rozsahu adsorpce a tím vhodnosti zkoušky pro danou látku (viz tabulka 1). Použije se baňka obsahující zkoušenou látku, inokulum a sterilizační činidlo.
Obsah všech baněk se doplní minerálním médiem na 1 l a po promíchání se z každé baňky odebere vzorek pro stanovení počáteční koncentrace DOC (viz příloha 2.4). Ústí baněk se zakryjí např. hliníkovou fólií tak, aby byla možná volná výměna vzduchu mezi baňkami a okolní atmosférou. Pak se nádoby umístí do třepačky čímž se zahájí zkouška.
III.2.5 Počet baněk v typické zkoušce
Baňka 1 a 2: Zkoušená suspenze
Baňka 3 a 4: Slepý pokus s inokulem
Baňka 5: Kontrola postupu
Pokud možno a je-li třeba:
Baňka 6: Abiotická sterilní kontrola
Baňka 7: Kontrola adsorpce
Baňka 8: Kontrola toxicity
Viz také bod I.6.7.
III.2.6 Provedení zkoušky
Během zkoušky se ve známých časových intervalech stanoví dvojmo koncentrace DOC v každé baňce, a to dostatečně často, aby bylo možné určit začátek 10-denního okénka a procentní úbytek na konci 10-denního okénka. Pro každé stanovení je třeba odebírat pouze minimální nutné množství zkoušené suspenze.
Před odběrem vzorků se případně nahradí ztráty odpařováním z baněk přidáním potřebného množství zřeďovací vody (I.6.1). Před odběrem vzorků je třeba kultivační médium dobře promíchat a zajistit, aby látky ulpělé na stěnách nádob přešly do roztoku nebo suspenze. Ihned po odběru je třeba vzorky zfiltrovat přes membránu nebo zcentrifugovat (viz přílohu 2.4). Zfiltrované resp. zcentrifugované vzorky je třeba analyzovat týž den, jinak je možné je přechovávat nejdéle 48 hodin při 2 - 4 °C nebo po delší dobu při teplotě nižší než - 18 °C.