1 Metoda
1.1 Úvod
Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti ve vodě rozpustných netěkavých organických látek statickou zkouškou, při které jsou tyto látky vystaveny účinku vysokých koncentrací mikroorganismů.
Při interpretaci výsledků musí být zohledněna fyzikálně-chemická adsorbce na suspendované pevné částice.
Zkoušené látky jsou zřeďovány v koncentracích odpovídajících hodnotám DOC nebo TOC od 50 do 400 mg.l-1 nebo hodnotám CHSK 100 - 1000 mg.l-1. Tyto poměrně vysoké koncentrace umožňují dostatečně spolehlivou analýzu.
Sloučeniny s toxickými vlastnostmi mohou však proces rozkladu zpomalit.
Mírou biologické rozložitelnosti zkoušené látky v této metodě je úbytek rozpuštěného organického uhlíku nebo chemická spotřeba kyslíku. Specifickými analytickými metodami může být stanovena i primární biologická rozložitelnost látek.
Touto metodou mohou být zkoušeny pouze organické látky, které při koncentracích použitých ve zkoušce:
- jsou za podmínek zkoušky rozpustné ve vodě,
- mají za podmínek zkoušky nevýznamnou tenzi par,
- neinhibují bakterie,
- jsou ve zkušebním systému jen omezeně adsorbovány,
- pěněním nesnižují svou koncentraci ve zkoušeném roztoku.
Pokud jsou stanoveny nízké nebo marginální hodnoty biologické rozložitelnosti, je nutné pro interpretaci výsledků znát obsah nejdůležitějších komponent zkoušené látky.
Pro interpretaci nižších hodnot biologické rozložitelnosti a volbu vhodných koncentrací zkoušené látky jsou důležité rovněž informace o toxicitě zkoušené látky.
1.2 Definice a jednotky
Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase se vypočítá podle vztahu:
C - C
T B
D (%) = [1 - ----------- ] . 100
T C - C
A BA
kde:
D = rozklad (%) v čase T,
T
-1
C = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky 3 h od zahájení zkoušky (mg.l ),
a
-1
C = hodnoty DOC (nebo CHSK) zkoušené látky v době odběru vzorku (mg.l ),
T
-1
C = hodnoty DOC (nebo CHSK) kontroly v době odběru vzorku (mg.l ),
B
-1
C = hodnoty DOC (CHSK) kontroly 3 h od zahájení zkoušky (mg.l ).
BA
Stupeň rozložitelnosti se zaokrouhluje na celá procenta.
Jako procentuální rozložitelnost je udáván procentuální úbytek hodnot DOC (nebo CHSK) zkoušené látky.
Rozdíl mezi hodnotami naměřenými po 3 h po zahájení zkoušky a mezi vypočítanými a zejména však naměřenými počátečními hodnotami, poskytuje užitečnou informaci o rozložitelnosti zkoušené látky (viz 3. 2).
1.3 Standardní látky
Při posuzování rozložitelnosti nových látek mohou být v jednotlivých případech využity referenční materiály, v této metodice však nejsou doporučeny žádné.
1.4 Princip metody
Aktivovaný kal, minerální živné médium a zkoušená látka ve vodném roztoku jako zdroj uhlíku se smíchají v 1 - 4 l skleněné nádobě s míchadlem a aeračním zařízením. Suspenze je míchána a aerována až 28 dní při teplotě 20 - 25 °C v difuzním světle nebo temnu. Rozklad je sledován denně nebo v jinak vhodně stanovených časových intervalech prostřednictvím měření hodnot DOC (nebo CHSK) v odebraném vzorku po jeho přefiltrování. Procentuální hodnota biologického rozkladu v čase je definována jako poměr mezi hodnotami DOC (nebo CHSK) v době odběru vzorku a po 3 h od zahájení zkoušky. Výsledek je vyjádřen graficky jako funkce času.
V případě, že se analyticky stanovují změny koncentrací původní molekuly látky, jsou tyto změny měřítkem primární biologické rozložitelnosti.
1.5 Kritéria kvality
Dostatečná reprodukovatelnost byla ověřena mezilaboratorními zkouškami.
Citlivost metody je značně závislá na variabilitě kontrolního vzorku, na poměrně malé přesnosti stanovení množství organického uhlíku a na koncentraci zkoušené látky v suspenzi.
1.6 Postup zkoušení
1.6.1 Příprava
1.6.1.1 Reagencie
-1
Voda: Pitná voda s obsahem organického uhlíku menším než 5 mg.l .
Koncentrace vápenatých a hořečnatých iontů nesmí překročit 2,7
-1
nmol.l , jinak je nutné jako rozpouštědlo použít deionizovanou nebo
destilovanou vodu.
-1
Kyselina sírová p. a. 50 g.l
-1
Hydroxid sodný p. a. 40 g.l
Minerální živné médium: v jednom litru deionizované vody se rozpustí:
Chlorid amonný NH Cl p. a. 38,5 g
4
NaH PO . 2H O p. a. 33,4 g
2 4 2
KH PO p. a. 8,5 g
2 4
K HPO p. a. 21,75 g
2 4
Tento roztok slouží zároveň jako tlumič pH.
1.6.1.2 Přístroje
Skleněné nádoby o objemu 1 - 4 l.
Skleněné nebo kovové míchadlo, které by mělo být umístěno 5 - 10 cm nad dnem nádoby. Použito může být rovněž magnetické míchadlo se 7 - 10 cm dlouhým ramenem.
Skleněná aerační trubice o vnitřním průměru 2 - 4 mm. Vyústění trubice by mělo být umístěno cca 1 - 10 cm nad dnem nádoby.
Odstředivka (cca 3 550 g).
pH - metr.
Oximetr.
Papírový filtr.
Membránový filtrační přístroj.
Membránový filtr o velikosti pórů 0,45 μm, který během filtrace neuvolňuje a neabsorbuje uhlík.
Analyzátor ke stanovení obsahu organického uhlíku a vybavení ke stanovení CHSK.
1.6.1.3 Příprava inokula
Aktivovaný kal z biologické čistírny se promývá opakovaně vodou předepsané kvality a buď se opakovaně centrifuguje nebo sedimentuje.
Aktivovaný kal musí mít vhodné složení, tzn., že musí obsahovat co nejvíce druhů bakteriálních kultur. Inokulum může být namícháno z různých zdrojů (např. z čistírny, z půdního extraktu, z říční vody, atd.).
Stanovení aktivity aktivovaného kalu je popsáno v kap. 1. 6. 2 nazvané Funkční kontrola.
1.6.1.4 Příprava pracovních roztoků zkoušené látky
Do zkušební nádoby odměříme 500 ml vody, 2,5 ml.l-1 minerálního živného roztoku a přidáme aktivovaný kal v množství 0,2 až 1,0 g.l-1 sušiny v konečné směsi a odpipetujeme takový objem základního roztoku zkoušené látky, aby bylo dosaženo koncentrace rozpuštěného organického uhlíku od 50 do 400 mg.l-1suspenze. Odpovídající hodnoty CHSK jsou 100 až 1000 mg.l-1. Doplníme vodou na celkový objem 1 - 4 l. Zvolený objem je závislý na počtu odebíraných vzorků nutných ke stanovení hodnot DOC nebo CHSK a na tom, kolik odběrů bude vyžadovat zvolený analytický postup.
Zpravidla postačuje objem 2 l. Současně je s každou zkušební sérií nasazena alespoň jedna kontrola, do které je odměřen aktivovaný kal a minerální živné médium doplněné na stejný objem jako má zkoušená směs.
1.6.2 Pracovní postup
Kultivační nádoby se inkubují při difuzním světle nebo v tmavé komoře při teplotě 20 - 25 °C, za stálého míchání pomocí magnetického míchadla nebo šroubovitého míchadla. Nádoba se provzdušňuje tlakovým vzduchem, který je čištěn, pokud je to potřebné, vatovým filtrem nebo přes promývačku. Musí být zajištěno, aby nedošlo k usazování kalu a koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesla pod 2 mg.l-1.
V pravidelných časových intervalech se měří pH (např. denně) a pokud je to potřebné upravuje se na hodnotu pH 7 - 8.
Ztráty vypařováním se vyrovnávají destilovanou nebo deionizovanou vodou vždy před odebráním vzorku. Je účelné označit hladinu kapaliny před začátkem zkoušky a znovu zaznamenat výšku hladiny po odebrání vzorku při vypnuté aeraci a míchání. První vzorky se odebírají 3 h po zahájení zkoušky, aby aktivovaný kal dostatečně adsorboval zkoušenou látku.
Rozklad zkoušené láky se sleduje stanovením hodnoty DOC a CHSK v pravidelných časových intervalech. Vzorky z nádoby se zkoušenou látkou a z kontroly se před analýzou filtrují na promytém papírovém filtru. Prvních 5 ml filtrátu se vylévá. Kaly, které se špatně filtrují mohou být odděleny 10 min odstředěním. Stanovení DOC a CHSK se provede nejméně dvakrát. Všechny baňky se nechají inkubovat 28 dní.
Poznámka: Vzorky, které jsou po uvedeném postupu ještě zakalené, se filtrují na membránovém filtru, který nesmí uvolňovat nebo adsorbovat organické látky.
Funkční kontrola aktivovaného kalu
Paralelně se ke každé sérii pokusů nasazuje referenční nádoba s kalem, médiem, vodou a referenční látkou, která slouží ke kontrole citlivosti aktivovaného kalu. Doporučován je diethylenglykol.
Adaptace
V relativně krátkých časových intervalech (např. denně) jsou prováděny analýzy a naměřené hodnoty jsou vynášeny do grafu. Na inhibiční křivce lze zpočátku rozlišit tzv. adaptační fázi (viz obr. 2), proto by zkouška neměla být nasazována ke konci týdne. Jestliže na konci normální délky zkoušky dochází znovu k adaptaci, může být zkouška prodloužena až do konečného rozložení zkoušené látky.
Upozornění: Pokud chcete důkladně poznat chování aktivovaného kalu, upravte ho následujícím způsobem:
Míchadlo a aerační zařízení se vypne, aby se mohl aktivovaný kal usadit. Kapalná fáze se vypustí, dekantovaný kal v nádobě se doplní vodou na objem 2 l, 15 min se míchá a znovu se nechá sedimentovat. Kapalná fáze se znovu vypustí a zkouška se opakuje se sedimentovaným kalem a stejnou zkoušenou látkou podle kap. 1.6.1.4 a 1.6.2. Aktivovaný kal může být upraven také centrifugací.
Adaptovaný kal může být smíchán s čerstvým aktivovaným kalem tak, aby bylo dosaženo koncentrace 0,2 - 1 g sušiny na litr suspenze.
Příprava pro analýzu
Vzorky se filtrují přes promyté papírové filtry (k promývání se používá deionizovaná voda).
Zakalené vzorky se filtrují přes membránové filtry (0,45 μm).
Ve filtrátech vzorku (prvních 5 ml filtrátu se nepoužívá) se přístrojem na měření TOC stanoví dvakrát koncentrace rozpuštěného uhlíku DOC. Jestliže nemůže být filtrát analyzován v den odběru vzorku, musí být do příštího dne uchován v ledničce. Delší skladování se však nedoporučuje.
CHSK se ve filtrátu vzorku stanoví standardním postupem podle této vyhlášky.