1 Metoda
Metoda je založena na doporučeních OECD (1).
1.1 Úvod
Hydrolýza je důležitá reakce ovlivňující abiotický rozklad. U látek, které jsou jen málo biologicky rozložitelné má obzvláštní význam a může ovlivnit persistenci dané látky v životním prostředí.
Většina hydrolýzních reakcí probíhá jako reakce pseudoprvního řádu, takže poločasy jsou nezávislé na koncentraci. To zpravidla dovoluje extrapolaci výsledků z koncentrací použitých v laboratoři na podmínky životního prostředí.
Mimo to byly u řady chemických sloučenin uvedeny příklady uspokojivé shody dat naměřených v čisté a v přírodní vodě (2).
Pro používání této zkušební metody je užitečné znát již předem údaj o tenzi par dané látky.
Metoda je vhodná jen pro látky rozpustné ve vodě. Nečistoty zpravidla ovlivňují výsledky.
Chování látek při hydrolýze je nutno zkoumat při hodnotách pH obvykle se vyskytujících v životním prostředí (pH 4 - 9).
1.2 Definice a jednotky
Hydrolýzou se rozumí reakce látky RX s vodou, která se dá znázornit výměnou skupiny X za skupinu OH:
RX + HOH = ROH + HX (1)
Rychlost, kterou ubývá koncentrace RX, je dána vztahem:
rychlost = k . [H O] . [RX] (2)
2
Protože je voda přítomna vůči zkoušené látce v přebytku, popisuje se tento typ reakce obvykle jako reakce pseudoprvního řádu, ve které je zjištěná rychlostní konstanta dána výrazem:
k = k . [H O] (3)
obs 2
a lze ji určit pro dané pH a teplotu T z výrazu:
C
2,303 0
k = -------- . log ----- (4)
obs t C
t
kde
t = čas,
C = koncentrace látky v čase nula,
o
C = koncentrace látky v čase t,
t
2,303 = přepočítací faktor mezi přirozeným logaritmem a logaritmem
při základu 10.
-1 -1
Koncentrace je možné udávat v g.l nebo v mol.l .
-1
Jednotkou konstanty k je (čas) .
obs
"Poločas", t , je definován jako doba, po jejímž uplynutí je
1/2
počáteční množství látky sníženo o 50 %:
C = 1/2 . C (5)
t o
Z rovnic (4) a (5) plyne, že
t = 0,693/k (6)
1/2 obs
1.3 Referenční látky
Pokud se studuje nová látka, není nutné vždy používat referenční látky. Referenční látky by měly sloužit především k občasné kontrole měřicí metody a k vzájemnému porovnávání výsledků získaných různými metodami.
Jako standardní látky byly použity (1):
Kyselina acetylsalicylová (aspirin),
0,0-diethyl-0-(6-methyl-2-(1methylethyl)-4-pyrimidinyl)-ester kyseliny thiofosforečné (Dimpylat, Diazinon).
1.4 Princip metody
Látka se rozpustí v malé koncentraci ve vodě, kontrolují se pH a teplota.
Vhodnou analytickou metodou se sleduje pokles koncentrace látky v závislosti na čase.
Logaritmy koncentrace se vynesou proti času. Je-li získaná závislost lineární, je možné získat rychlostní konstantu 1. řádu ze směrnice přímky (viz odst. 2).
Není-li možné rychlostní konstantu zjistit při zadané teplotě přímo, je obvykle možné ji odhadnout podle Arrheniova vztahu, který udává teplotní závislost rychlostních konstant. Za tím účelem se vynesou logaritmy rychlostních konstant získaných při jiných teplotách proti reciproké hodnotě absolutní teploty (K). Z lineárního průběhu je možné extrapolovat nebo interpolovat hodnoty těch rychlostních konstant, které nebyly určeny přímo.
1.5 Kritéria kvality
V literatuře (2) se uvádí, že měření rychlostních konstant hydrolýzy lze u 13 tříd organických sloučenin provádět s vysokou přesností.
Reprodukovatelnost závisí zejména na kontrole pH a teploty a může být ovlivněna přítomností mikroorganismů a ve zvláštních případech koncentrací rozpuštěného kyslíku.
1.6 Popis metody
1.6.1 Činidla
1.6.1.1 Tlumivé roztoky
Zkouška se provádí při třech hodnotách pH: 4,0; 7,0 a 9,0.
Pro tento účel je třeba připravit tlumivé roztoky za použití chemikálií čistoty pro analýzu a destilované nebo deionizované vody. V příloze jsou uvedeny některé příklady těchto systémů.
Použitý tlumivý roztok může ovlivnit rychlost hydrolýzy. Při tomto zjištění je třeba zvolit jiný tlumivý roztok. V literatuře (2) se doporučuje použít místo fosforečnanových boritanové a acetátové tlumivé roztoky.
Není-li známo pH tlumivých roztoků pro příslušnou teplotu zkoušky, je nutné ho stanovit cejchovaným pH - metrem při zvolené teplotě s přesností na 0,1 jednotek pH.
1.6.1.2 Zkoušené roztoky
Zkoušená látka se rozpustí ve zvoleném tlumivém roztoku. Koncentrace by neměla překročit 0,01 mol.-l nebo polovinu nasycené koncentrace, podle toho, která z těchto hodnot je nižší.
Používání organických rozpouštědel mísitelných s vodou se doporučuje jen pro látky s nižší rozpustností ve vodě. Množství látky zprostředkující rozpouštění má být menší než 1 % a nemá ovlivnit průběh hydrolýzy.
1.6.2 Aparatura
Používají se skleněné baňky se zátkami (bez tuku).
Pokud jsou látka nebo složky tlumivého roztoku těkavé, nebo pracuje-li se při vyšších teplotách, měly by se přednostně používat zkušební nádoby utěsněné nebo uzavřené septem, s co nejmenším objemem plynu nad kapalinou v nádobě.
1.6.3 Analytická metoda
Použitá analytická metoda je dána druhem zkoušené látky. Musí být dostatečně přesná a citlivá, aby dokázala zjistit úbytek počáteční koncentrace o 10 %. Musí být dostatečně specifická,, aby umožnila stanovení zkoušené látky v koncentraci zkušebního roztoku a může být tvořena kombinací vhodných analytických technik.
1.6.4 Zkušební podmínky
Zkoušky se provádějí za použití zařízení s kontrolou teploty nebo s použitím termostatované lázně, nastavené na 0,5 °C přesně. Vhodnými opatřeními je nutné zabránit fotolytickým vlivům.
Dále je nutné učinit veškerá vhodná opatření, aby se odstranil rozpuštěný kyslík (např. se po 5 minut před připravou roztoku nechá procházet dusík nebo argon).
1.6.5 Metoda měření
1.6.5.1 Předběžná zkouška
Pro všechny látky se musí provést předběžná zkouška při 50 ± 0,5 °C a při každé ze tří hodnot pH 4,0; 7,0 a 9,0. Je třeba provést dostatečný počet měření, aby bylo možné pro každé pH rozhodnout, zda při 50 °C je poločas (t1/2) menší než 2,4 hodiny nebo zda po 5 dnech zhydrolyzuje méně než 10 %. (Je možné odvodit, že tyto hodnoty odpovídají za podmínek, které se nejčastěji vyskytují v životním prostředí (25 °C), poločasu kratšímu než jeden den nebo delšímu než 1 rok). Jestliže se v předběžném experimentu prokáže, že při 50 °C se za 2,4 hodiny zhydrolyzuje 50 % nebo více zkoušené látky nebo po 5 dnech méně než 10 % při všech třech hodnotách pH (4,0; 7,0; 9,0), nejsou další experimenty nutné. V ostatních případech a v případech jednotlivých hodnot pH, pro která tomu tak není, se provede zkouška č. 1.
1.6.5.2 Zkouška č. 1
Při hodnotách pH, pro které se v předběžné zkoušce ukázala nutnost dalších zkoušek, provede se zkouška č. 1. Pracuje se při jedné teplotě, nejlépe při 50 °C ± 0,5 °C a pokud možno ve sterilních podmínkách.
Za účelem prověření průběhu reakce podle pseudoprvního řádu se pro každou zvolenou hodnotu pH bere pro pokrytí oblastí mezi 20 % a 70 % hydrolýzy dostatečný počet vzorků (ne méně než 4).
Pro každé pH, při kterém se provádí zkouška č. 1, se stanoví řád reakce.
Odhad rychlostních konstant při 25 °C:
Rozhodnutí o dalším experimentálním postupu závisí na tom, zda ze zkoušky č. 1 lze usuzovat na reakci pseudoprvního řádu nebo ne.
Pokud ze zkoušky č. 1 nelze s jistotou usuzovat na reakci pseudoprvního řádu, je třeba provést další experimenty podle zkoušky č. 2.
Vyplývá-li ze zkoušky č. 1 s jistotou reakce pseudoprvního řádu, provedou se další experimenty podle zkoušky č. 3 (alternativně je možné za zvláštních okolností vypočítat rychlostní konstanty při 25 °C z konstant při 50 °C vypočtených s použitím údajů ze zkoušky č. 1, viz odstavec 3.2).
1.6.5.3 Zkouška č. 2
Tato zkouška se provádí při každém pH, pro které se to na základě výsledků zkoušky č. 1 ukázalo potřebným:
- buď při teplotě nižší než 40 °C,
- nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
Při každém pH a každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 2, je třeba provést v nejméně 6 přiměřených časových intervalech měření v oblasti stupně hydrolýzy 20 až 70 %.
Při každém pH se provede opakované měření při jedné teplotě. Pokud se zkouška č. 2 provádí při dvou teplotách nad 50 °C, je vhodné opakovat měření nejlépe při nižší z těchto dvou teplot.
Pro každé pH a každou teplotu, pro které se provádí zkouška č. 2, je třeba, pokud je to možné, provést grafický odhad poločasu (t1/2).
1.6.5.4 Zkouška č. 3
Zkouška se provede při každém pH, pro které se to ukázalo potřebným na základě výsledků zkoušky č. 1:
- buď při teplotě nižší než 40 °C,
- nebo při dvou teplotách nad 50 °C, které se od sebe liší nejméně o 10 °C.
Při každém pH a při každé teplotě, při kterých se provádí zkouška č. 3 se zvolí tři měřicí body, první v čase 0, druhý a třetí při stupni hydrolýzy vyšším než 30 %; spočítá se konstanta kobs a t1/2.