1 Metoda
1.1 Úvod
1.1.1 Obecné poznámky
Metoda je vhodná pouze pro ty organické látky, které v používaných koncentracích:
- jsou natolik rozpustné ve vodě, aby bylo možné připravit zásobní roztok,
- mají za podmínek zkoušky zanedbatelnou tenzi par,
- neinhibují bakterie.
Je užitečné mít informace o relativním podílu nejdůležitějších komponent obsažených ve zkoušeném materiálu, zvláště tehdy, když biologická rozložitelnost dosahuje nízkých nebo marginálních hodnot. Při interpretaci nízkých hodnot biologické rozložitelnosti a volbě vhodné zkušební koncentrace je potřebné znát údaje o toxicitě látky vůči mikroorganismům.
1.1.2 Stanovení úplné biologické rozložitelnosti (analýza DOC/CHSK)
Cílem metody je stanovení úplné biologické rozložitelnosti organické látky na základě měření úbytku zkoušené látky a vzniklých metabolitů v koncentracích DOC více než 12 mg.l-1 (nebo CHSK cca 40 mg.l-1) ve zkušebním zařízení s náplní aktivovaného kalu. Prokázalo se, že optimální je koncentrace DOC 20 mg/l.
Je nutné znát obsah organického uhlíku nebo CHSK zkoušené látky.
1.1.3 Stanovení primární biologické rozložitelnosti (specifická analýza)
Cílem metody je stanovení primární biologické rozložitelnosti zkoušené látky při koncentraci cca 20 mg/l v modelovém zařízení s aktivovaným kalem (pokud to umožňuje analytická metoda nebo toxicita zkoušené látky, může být použita koncentrace zkoušené látky vyšší nebo nižší). To dovolí odhadnout primární biologickou rozložitelnost zkoušené látky (vymizení původní "rodičovské" chemické struktury).
Cílem metody není stanovení stupně mineralizace zkoušené látky.
Ke kvantitativní analýze musí být k dispozici vhodná metoda.
1.2 Definice a jednotky
1. 2. 1 Analýza DOC/CHSK
Úbytek látky je vyjádřen vztahem:
T - (E - E )
o
DR = ------------- . 100 % (1a)
T
DR = DOC nebo CHSK úbytek v % vztažený na zkoušenou látku při dané
střední době prodlení,
-1
T = koncentrace zkoušené látky na přítoku do zkušební jednotky v mg.l DOC
nebo CHSK,
-1
E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku ze zkušební jednotky v mg.l ,
-1
E = koncentrace DOC nebo CHSK na odtoku z kontrolní jednotky v mg.l .
o
Rozklad je definován jako procentuální úbytek DOC nebo CHSK při udané době zdržení, vztažený na zkoušenou látku.
1. 2. 2 Specifická analýza
Procentuální odstranění zkoušené látky z vodné fáze (Rw) během udaného času prodlení:
C - C
1 0
R = ----------- . 100 % (1b)
W C
1
-1
C = koncentrace zkoušené látky v přítoku do zkušebního zařízení (v mg.l )
1 stanovená specifickou analýzou,
-1
C = koncentrace zkoušené látky na odtoku ze zkušebního zařízení (v mg.l )
0 stanovená specifickou analýzou.
1.3 Referenční látky
Při zkoušení nových látek je někdy vhodné použít referenční látku. Specifické referenční látky doposud nejsou doporučeny.
1.4 Princip zkušebních metod
Ke stanovení úplné biologické rozložitelnosti se používají dvě paralelně pracující modelová zařízení s aktivovaným kalem (potvrzující zkouška OECD nebo zařízení s porézní nádobkou). Zkoušená látka se přidává na přítoku do jedné z jednotek (se syntetickou nebo s komunální vodou), zatímco ve druhé je obsažena pouze odpadní voda. Ke stanovení primární biologické rozložitelnosti pomocí specifické analýzy zkoušené látky na přítoku a odtoku je zapotřebí jedna jednotka.
Na odtoku se měří koncentrace DOC nebo CHSK nebo se stanoví koncentrace zkoušené látky specifickou analýzou.
DOC zkoušené látky se nestanovuje, pouze se konstatuje.
Při měření DOC nebo CHSK se vychází z toho, že rozdíl mezi průměrnými koncentracemi na odtoku ze zkušební a z kontrolní jednotky je způsoben nerozloženou částí zkoušených látek.
Jestliže jsou prováděny specifické analýzy, lze stanovovat změny koncentrace původní chemické látky (primární biologická rozložitelnost).
Obě zařízení mohou být provozována jako "spřažená" pomocí postupu vzájemné inokulace.
1.5 Kritéria kvality
Koncentrace zkoušené látky se volí s ohledem na druh analytické metody a její mez stanovitelnosti.
1.6 Popis zkušební metody
1.6.1 Příprava
1 6.1.1 Přístroje
Pokud se neprovádí specifická analýza, používají se dvě modelové zkušební jednotky stejného typu. Mohou být používány dva typy zařízení:
Potvrzující zkouška OECD
Zařízení se skládá ze zásobní nádoby (A) na syntetickou odpadní vodu, dávkovacího čerpadla (B), aerační nádoby (C), sedimentační nádoby (D), mamutky (E) k recirkulaci aktivovaného kalu a sběrné nádoby vyčištěné vody (F).
Nádoby (A a F) musí být ze skla nebo z vhodné umělé hmoty objemu nejméně 24 l. Čerpadlo (B) musí zajišťovat konstantní přítok syntetických splašků do aerační nádoby. Použit může být jakýkoliv vhodný systém zajišťující stanovený přítok a koncentraci. Za normálních podmínek je výška separátoru (D) nastavena tak, aby objem kultivační suspenze v aerační nádobě byl 3 l. V dolní části konické části aerační nádoby je ponořena porézní aerační krychlička. Množství dodávaného vzduchu může být kontrolováno průtokoměrem. Mamutka (E) je osazena tak, aby byl aktivovaný kal ze separátoru do aktivační nádoby dopravován rovnoměrně.
Zařízení s porézní nádobkou
Porézní nádobka je vyrobena z porézní polyethylenové fólie (tloušťka 2 mm, maximální velikost pórů 95 mikronů) stočené do válce o průměru 14 cm s konickým dnem 45 °, obrázky 1 a 2 v příloze 2. Porézní nádobka je umístěna v nepropustné nádobě o průměru 15 cm zhotovené z vhodné umělé hmoty, která má nad konickou částí odtok ve výšce 17,2 cm, čímž je v zařízení vymezen objem 3 l. Na horním konci vnitřní nádoby je upevněn kruhový držák tak, že mezi vnější a vnitřní nádobou je 0,5 cm odtoková mezera.
Celé zařízení je umístěno do vodní lázně regulované termostatem. Vzduch je přiváděn na dno vnitřní nádoby pomocí vhodného rozvaděče.
Nádoby (A) a (E) musí být vyrobeny ze skla nebo vhodné umělé hmoty a mají mít objem nejméně 24 l. Čerpadlo (B) umožňuje konstantní přítok odpadních vod do aerační nádoby. Může být použit jakýkoliv vhodný systém za předpokladu, že zaručuje stanovený přítok a koncentraci.
K dispozici musí být zásoba dalších porézních nádobek jako náhrada za zanesené; zanesené nádobky se čistí namočením na 24 hodin do roztoku chlornanu sodného a promytím pitnou vodou.
1.6.1.2 Filtrace
Používají se membránové filtrační přístroje a membránové filtry (velikost pórů 0,45 μm). Membránový filtr nesmí uvolňovat uhlík ani nesmí adsorbovat zkoušenou látku při filtraci.
1.6.1.3 Odpadní voda
Může být použito buď vhodné syntetické médium nebo komunální odpadní voda.
Příklad syntetického média:
V 1 l pitné vody se rozpustí:
pepton 160 mg,
masový extrakt 110 mg,
močovina 30 mg,
NaCl 7 mg,
CaCl2 . 2 H2O 4 mg,
MgSO4 . 7 H2O 2 mg,
K2HPO4 28 mg.
Komunální odpadní vody:
Odebírají se čerstvé každý den z přepadu mechanického stupně čistírny, která čistí převážně městské odpadní vody.
1.6.1.4 Zásobní roztok zkoušené látky
Připraví se např. 1 % roztok zkoušené látky, který se bude přidávat do zkušební jednotky. Stanoví se koncentrace zkoušené látky a určí se příslušný objem zásobního roztoku, který je potřebné přidat k odpadní vodě nebo dalším čerpadlem přímo do zkušební jednotky, aby byla dosažena požadovaná zkušební koncentrace.
1.6.1.5 Inokulum
Poznámka: Je-li používána komunální odpadní voda není vhodné používání inokula s malou koncentrací bakterií, ale má se používat aktivovaný kal.
Mohou se používat inokula z různých zdrojů.
Příklady vhodného inokula:
a) Inokulum z odtoku biologické čistírny odpadních vod
Inokulum může být získáno z odtoku dobře fungující čistírny zpracovávající převážně komunální odpadní vody. Vzorek odtoku musí být v době mezi odběrem a použitím uchován v aerobních podmínkách. Inokulum se připraví filtrací vzorku vody přes hrubý filtr, prvních 200 ml filtrátu se vyleje. Až do okamžiku použití se filtrát uchovává v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito ve stejný den kdy bylo připraveno. K inokulaci se užívá nejméně 3 ml.
b) Směsné inokulum
Inokulum odebrané z odtoku čistírny:
Viz předchozí popis.
Inokulum z půdy:
100 g zahradní zeminy (úrodná, nesterilní zemina) se suspenduje v 1 l nechlórované pitné vody (nevhodné jsou zeminy s vysokým obsahem jílu, písku a humusu). Po zamíchání se nechá suspenze 30 minut dekantovat. Kapalná fáze se přefiltruje, prvních 200 ml se vyleje. Filtrát se ihned provzdušňuje až do okamžiku použití. Inokulum je možné použít pouze ten den, kdy bylo připraveno.
Inokulum z povrchové vody:
Další díl směsného inokula se získává z mesosaprobních povrchových vod. Odebraný vzorek se filtruje, prvních 200 ml se vyleje. Až do okamžiku použití se filtrát udržuje v aerobních podmínkách. Inokulum musí být použito pouze ten den, kdy bylo připraveno.
Směsné inokulum se získá smísením a dobrým promícháním stejných objemových dílů všech tří dílčích inokulí. K očkování se používají nejméně 3 ml směsného roztoku.
c) Inokulum z aktivovaného kalu
Používá se aktivovaný kal (s obsahem suspendovaných pevných částic do 2,5 g/l) odebraný z aerační nádrže čistírny komunálních odpadních vod.
1.6.2 Postup
Zkouška se provádí při laboratorní teplotě, která se má udržovat mezi 18 - 25 °C.
Zkouška může být event. prováděna při nižších teplotách (do 10 °C). Pokud se zkoušená látka za těchto podmínek rozkládá, nejsou zapotřebí žádná další měření. Jestliže však při nižší teplotě rozkládána není, musí být zkouška opakována při teplotě 18 - 25 °C.
1.6.2.1 Fáze zapracování: tvorba kalu/stabilizace kalu
Fází růstu/stabilizace kalu je období, během kterého dochází za provozních podmínek k ustálení koncentrace aktivovaného kalu a funkce zkušební jednotky.
Rozběhová fáze začíná první vsádkou zkoušené látky a končí dobou, kdy naměřený úbytek zkoušené látky dosáhne relativně konstantní hodnoty. Tato fáze by neměla trvat déle než 6 týdnů.
Hodnotící fáze je doba trvající 3 týdny od okamžiku kdy úbytek zkoušené látky dosáhl relativně konstantní, zpravidla vysoké, hodnoty. Pro látky, které se během šest týdnů trvající rozběhové fáze nerozkládají nebo jejich úbytek dosahuje nízkých hodnot se za vyhodnocovací fázi považuje období dalších tří následujících týdnů.
Na začátku zkoušky se zkušební jednotka(y) naplní zkušební kapalinou s inokulem.
Zapne se provzdušňování a mamutka (při použití zkušebního zařízení podle OECD) a zapne se dávkovací zařízení.
Přítok odpadních vod bez zkoušené látky do aerační nádoby se udržuje na rychlosti 1 l.h-1 nebo 1/2 l.h-1; doba zdržení tak dosáhne 3 h nebo 6 h.
Intenzita provzdušňování musí být regulována tak, aby se udržoval obsah aerační nádoby ve vznosu a obsah rozpuštěného kyslíku neklesl pod hodnotu 2 mg.l-1.
Pěnění směsi se zabraňuje vhodnými prostředky, které neinhibují kal.
Kal, který se shromažďuje v horní části aerační nádoby a u průkazné zkoušky OECD na dně sedimentační nádoby a v cirkulačním okruhu musí být alespoň jednou za den vracen do matečné suspenze setřením nebo jiným vhodným způsobem.
Jestliže kal špatně sedimentuje lze zvýšit jeho hustotu přídavkem 2 ml 5 % roztoku chloridu železitého. Přídavek je možné opakovat podle potřeby.
Odtok ze sedimentační nádrže se shromažďuje v nádobách E nebo F po dobu 20 - 24 hod. Před odebráním vzorku se směs důkladně promíchá. Nádoby E a F se musí pečlivě čistit.
Pro potřeby sledování účinnosti procesu a pro potřeby jeho řízení se stanoví nejméně dvakrát týdně CHSK nebo DOC zfiltrovaného průměrného vzorku výtoku ze zařízení a filtrované směsi dávkované do zařízení. K filtraci se používá membránový filtr s velikostí pórů 0,45 μm. Prvních 20 ml filtrátu se vyleje.
Pokud se rozkladné procesy ustálí, vyrovnají se i poklesy CHSK nebo DOC.
Sušina kalu v aerační nádobě se stanovuje dvakrát týdně (g.l-1).
Zařízení mohou být provozována dvěma způsoby: pokud je sušina kalu vyšší než 2,5 g.l-1 přebytečný kal se vypustí nebo se denně odebere z každé nádoby 500 ml suspenze, takže střední doba zdržení kalu v zařízení je 6 dní.
Jestliže jsou naměřené a hodnocené parametry (účinnost metody stanovená na základě úbytku CHSK nebo DOC, koncentrace kalu, schopnost sedimentace kalu, zákal kapalné fáze v sedimentační nádobě atd.) dvou jednotek dostatečně stabilní, může být zahájeno přidávání zkoušené látky dle kap. 1.6.2.2 do nátoku do jedné z jednotek.
Alternativně může být zkoušená látka přidávána na začátku fáze růstu kalu (1.6.2.1), zvlášť tehdy, když je jako inokulum používán aktivovaný kal.
1.6.2.2 Pracovní postup
Za dodržování podmínek pro rozběhovou fázi se do přítoku do zkušebního zařízení přidává zásobní roztok zkoušené látky (cca 1 %), aby obsah DOC v suspenzi byl v rozmezí 10 - 20 mg.l-1 nebo CHSK 40 mg.l-1.
Zásobní roztok se buď denně přimíchává do odpadní vody nebo se přivádí pomocí čerpadla přímo do suspenze. Koncentrace se postupně zvyšuje až na požadovanou hodnotu. Vyzkoušeny mohou být i vyšší koncentrace než udává předchozí odstavec, pokud nemá zkoušená látka na aktivovaný kal toxické účinky.
Do kontrolní jednotky se dávkuje pouze odpadní voda bez zkoušené látky. Z odtoku se odebírají vzorky pro analýzu a filtrují se na membránovém filtru s velikostí pórů 0,45 μm. Prvních 20 ml filtrátu se vylévá.
Filtráty vzorků musí být analyzovány v den odběru nebo musí být konzervovány (např. přídavkem 0,05 ml 1 % chloridu rtuťnatého na 10 ml filtrátu, uložením na 24 h při teplotě 2 - 4 °C nebo při - 18 °C na delší dobu).
Doba trvání rozběhové fáze od okamžiku přídavku zkoušené látky by neměla překročit 6 týdnů. Vyhodnocovací fáze by neměla být kratší než 3 týdny, aby bylo možné provést 14 - 20 stanovení nutných k vyhodnocení zkoušky.
Spřažená zařízení
Zařízení jsou spřažena tak, že je mezi nimi 1 x denně vyměňováno 1,5 l suspenze (včetně kalu) z aeračních nádob. Dochází-li k silné adsorbci zkoušené látky, odebere se 1,5 l kapalné fáze ze sedimentační nádoby a přidává se do aerační nádoby druhého zařízení.
1.6.2.3 Analytika
Ke sledování chování zkoušené látky se používají dvě metody stanovení:
DOC a CHSK.
Hodnoty DOC se stanoví dvakrát pomocí analyzátoru uhlíku a CHSK se stanoví podle literatury (2).
Specifická analýza
Koncentrace zkoušené látky se stanoví vhodnou analytickou metodou. Je-li to možné, stanoví se zvlášť množství látky adsorbované na aktivovaný kal.