1. Metodika
1.1 Princip testovací metody
Testovaná látka se podává vhodnou cestou. V závislosti na zaměření studie látka může být podávána jednorázově nebo opakovaně v průběhu stanovené doby, jedné nebo několika skupinám experimentálních zvířat. Látka resp. její metabolity jsou pak podle účelu studie stanovovány v tělních tekutinách, tkáních anebo v exkretech.
Studie mohou být prováděny s "neznačenou" či "značenou" formou testované látky. Jestliže je použito značení, umístí se tak, aby poskytlo co nejvíce informací o osudu sloučeniny v organismu.
1.2 Popis testovací metody
1.2.1 Přípravy
Zdravá mladá zvířata jsou aklimatizována na laboratorní podmínky nejméně po dobu pěti dnů před testováním. Před zahájením testování jsou zvířata náhodně rozdělena do skupin. Pro řešení specielních otázek se může použít velmi mladých, pregnantních či premedikovaných zvířat.
1.2.2 Experimentální podmínky
1.2.2.1 Pokusná zvířata
Toxikokinetické studie se provádějí na jednom či více vhodných živočišných druzích. Měly by se provádět na druzích užívaných nebo uvažovaných pro užití v jiných toxikologických studiích zabývajících se testovanou látkou. Jestliže jsou pro testování používání hlodavci, neměla by být variabilita hmotnosti vyšší než ± 20 % průměrné hodnoty.
1.2.2.2 Počet a pohlaví
Pro studium absorpce a vylučování se užije nejprve 4 zvířat pro každou jednotlivou dávku. Pro testování není dávána přednost určitému pohlaví, ale za určitých podmínek může vzniknout potřeba provádět studie na obou pohlavích. Jestliže jsou nalezeny rozdílné odpovědi u různých pohlaví, potom je třeba testovat 4 zvířata každého pohlaví. V případě ostatních druhů zvířat (jiných než hlodavců) je možné použít menší počet zvířat.
Je-li studována tkáňová distribuce, pak při určení počáteční velikosti skupiny zvířat je třeba brát v úvahu jak počet zvířat, která budou utracena v každém časovém bodu, tak počet časových bodů v nichž bude testování prováděno.
Je-li studován metabolismus, pak velikost skupiny zvířat je úměrná potřebám studie.
Zahrnuje-li studie větší počet dávek a sledovaných časových intervalů, pak velikost skupiny zvířat by měla počítat s počtem časových intervalů a plánovaným utrácením zvířat, ale ve skupině nesmí být méně než 2 zvířata. Velikost skupiny zvířat by měla být dostatečná na to, aby pro látku resp. její metabolity poskytla přijatelné charakteristiky ve fázi retence, rovnovážného stavu a deplece.
1.2.2.3 Dávky
V případě jednorázového podání by měly být použity nejméně 2 různé dávky testované látky. Měla by to být nízká dávka látky, po které nebyly pozorovány žádné toxické účinky a vysoká dávka, po které mohou být nalezeny změny v toxikokinetických parametrech nebo která vyvolává toxické účinky.
V případě opakovaného podávání je většinou dostatečné podání nízkých dávek látky. Za určitých podmínek může být nezbytné i podávání vysoké dávky.
1.2.2.4 Způsob aplikace
Toxikokinetické studie by měly být prováděny stejným způsobem aplikace a je-li to vhodné i se stejným vehikulem tak, jak jsou používány v ostatních toxikologických studiích. testovaná látka je obvykle podávána orálně sondou nebo v potravě, aplikována na kůži, nebo podávána inhalačně po určenou dobu skupině experimentálních zvířat. Intravenosní podání testované látky může být užitečné pro stanovení relativního vstřebávání při jiných způsobech aplikace. Navíc, krátce po intravenosní aplikaci látky mohou být získány důležité informace o distribuci látky v organismu.
Nemělo by se zapomínat na možnou interferenci vehikula s testovanou látkou. Pozornost by měla být rovněž věnována rozdílům ve vstřebávání v případě, je-li testovaná látka podána sondou nebo v potravě, a potřebě přesného stanovení dávky, zvláště je-li testovaná látka podávána v potravě.
1.2.2.5 Doba sledování
Všechna zvířata by měla být sledována denně a příznaky toxicity i další relevantní klinické údaje zaznamenávány spolu s údaji o jejich počátku, velikosti a trvání.
1.3 Popis postupu
Po zvážení pokusných zvířat je testovaná látka podána způsobem přiměřeným účelu. Ve zdůvodněných případech je možno nechat zvířata před podáním testované látky vyhladovět.
1.3.1 Absorpce
Ke sledování rychlosti a rozsahu absorpce podávané látky mohou být použity různé metody s nebo bez referenční skupiny 1), a to např.:
- stanovení množství testované látky a ev. jejím metabolitů v exkretech např. v moči, žluči, stolici, vydechovaném vzduchu a také jejích zbytků v karkasu,
- porovnání biologické odpovědi (např. studie akutní toxicity) mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
- porovnání množství látky resp. jejích metabolitů vylučovaných ledvinami mezi testovanou a kontrolní a případně referenční skupinou,
- stanovení plochy pod křivkou závislosti koncentrací testované látky a ev. jejích metabolitů v plazmě na čase a porovnání s daty získanými v referenční skupině.
------------------------------------------------------------------
1) V této metodě se referenční skupinou rozumí ta, ve které je testovaná látka podávána takovým způsobem, který zajišťuje úplnou biologickou dostupnost dávky.
1.3.2 Distribuce
V současné době jsou dostupné 2 přístupy, z nichž pro analýzu distribučního schematu mohou být použity jeden či oba:
- při použití celotělové autoradiografie lze získat užitečné kvalitativní informace;
- kvantitativní informace poskytuje stanovení koncentrací a množství testované látky a ev. jejích metabolitů v tkáních a orgánech získaných ze zvířat v různých časových intervalech po zahájení expozice.
1.3.3 Vylučování
Při studiu vylučování se sbírá moč, stolice, vydechovaný vzduch, v určitých případech žluč. Množství testované látky a ev. jejích metabolitů se v těchto exkretech stanovuje několikrát po podání látky, a to buď do vyloučení 95 % z podaného množství nebo nejvýše 7 dnů od počátku vylučování.
Ve specielních případech může být potřebné sledovat také vylučování testované látky v mléce v době laktace testovaných zvířat.
1.3.4 Metabolismus
K určení rozsahu a schematu metabolismu látky se biologické vzorky analyzují vhodnými technikami. Měla by být objasněna struktura metabolitů a navrženo odpovídající metabolické schema tam, kde je třeba odpovědět na otázky z přecházejících toxikologických studií. Pro získání informací o metabolismu může být prospěšné provedení in vitro studií.
Další informace o vztahu mezi metabolismem a toxicitou látky lze získat z biochemických studií např. studiem účinků látky na enzymy metabolického systému, sledováním poklesu endogenních neproteinových sloučenin obsahujících - SH skupiny a nebo vazby látky na makromolekuly.