1. Metodika
1.1 Princip testovací metody
Testovaná látka je podávána normálně sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity.
1.2. Popis testovací metody
1.2.1 Příprava
Zvířata jsou chována při standardních podmínkách aspoň 5 dní před započetím testu. Před testem jsou zdravá, mladá zvířata náhodně rozdělena do exponovaných a kontrolních skupin.
1.2.2 Testovací podmínky
1.2.2.1 Experimentální zvířata
Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce nebo jiné). Je třeba použít zdravé a mladé jedince běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20 % od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.
1.2.2.2 Počet a pohlaví
Pro každou úroveň dávky je třeba použít nejméně 40 zvířat (20 samic a 20 samců), stejně i pro kontrolní skupinu. Samice by měly být nullipary a neměly by být březí. Pokud je záměrem utratit některá zvířata před dokončením testu, je třeba použít přiměřeně vyšší počet zvířat.
V případě jiných druhů zvířat (nehlodavců) je možné použít menší počet zvířat, ale ne méně než 4 od každého pohlaví ve skupině.
1.2.2.3 Dávky a frekvence exposic
Je třeba použít aspoň tři dávky a jednu kontrolní skupinu. Nejvyšší dávka by měla vyvolat jasné projevy toxicity bez nadměrné úmrtnosti. Nejnižší dávka by neměla vyvolat prokazatelné projevy toxicity. Střední dávky by měly být voleny ve středním pásmu mezi vysokými a nízkými dávkami. Výběr dávek by měl vzít v úvahu výsledky předchozích studií.
Obvykle jsou zvířata exponována denně. V případě, že testovaná látka je podávána v pitné vodě nebo v potravě, je třeba zajistit, aby k ní měla zvířata stálý přístup.
1.2.2.4 Kontroly
Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu k exponované skupině, vyjma exposice testované látce.
Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.
1.2.2.5 Způsob aplikace
Dva hlavní způsoby aplikace jsou orální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu exposice člověka.
Použití dermální aplikace vyvolává značné technické problémy. Chronická systémová toxicita v důsledku kožního vstřebání může být normálně odvozena z výsledku orálního testu a znalosti rozsahu kožního vstřebávání, odvozené z předchozích testů kožní toxicity.
Orální studie
Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpouštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.
Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat "abstinenční" příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.
Inhalační studie
Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.
Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dnů v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.
Volba přerušované nebo kontinuální exposice závisí na cílech studia a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.
Exposiční komory
Zvířata se exponují v inhalačních komorách jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnout 5 % objemu komory.
Měření nebo monitorování zahrnuje:
(a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně;
(b) koncentrace: během denní exposice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ± 15 % střední hodnoty;
(c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2° C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně;
(d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být representativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během exposic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.
1.2.2.6 Trvání studie
Expozice látce by měla trvat nejméně 12 měsíců.
1.2.3 Popis postupu
1.2.3.1 Pozorování
Pečlivé klinické sledování by mělo být prováděno nejméně jednou denně. Dodatečná pozorování by měla být prováděna denně s odpovídajícími zákroky k minimalizaci ztráty zvířat ze studie, např. pitva nebo uložení do lednice u zvířat, která jsou nalezena mrtvá a isolace nebo utracení zvířat, která jsou slabá nebo moribundní. Zvířata je třeba pečlivě sledovat, aby se spolehlivě zachytil začátek a progrese všech toxických účinků, a také za účelem minimalizace ztrát v důsledku nemocí, autolýzy nebo kanibalismu.
Registrují se klinické příznaky včetně neurologických a očních změn u všech zvířat, a dále případy uhynutí. Zaznamenává se doba objevení a postup toxických příznaků včetně podezření na tumor.
Hmotnost se zaznamenává individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období. Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
1.2.3.2 Hematologická vyšetření
Hematologická vyšetření (např. obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erythrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo jiné ukazatele srážlivosti) by měla být prováděna za tři měsíce, šest měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve shromážděných od všech nehlodavců resp. od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od stejných potkanů. Navíc by měl být odebrán vzorek před testem od nehlodavců.
Pokud klinické vyšetření zvířat naznačí zhoršený zdravotní stav zvířat během studie, měl by být stanoven diferenciální obraz bílých krvinek.
Diferenciální obraz bílých krvinek se vyšetří ve vzorcích od zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, vyšetří se i u skupiny s dávkou nejblíže nižší.
1.2.3.3 Analýza moči
Vzorky moči 10 potkanů každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
- vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
- proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semi-kvantitativně),
- mikroskopické vyšetření sedimentu (semi-kvantitativně).
1.2.3.4 Biochemické vyšetření
V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví v každé skupině, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
- celková koncentrace proteinů,
- koncentrace albuminu
- testy na funkci jater (např. aktivita bázické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminasy 1), glutamát acetát transaminasy 2), gamma glutamyl transpeptidasy, ornithin dekarboxylasy,
- metabolismus glycidů, např. krevní glukosa na lačno,
- testy na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
------------------------------------------------------------------
1) nyní známá jako sérová alanin aminotransferasa
2) nyní známá jako sérová aspartát aminotransferasa
1.2.3.5 Pitva
Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v moribundním stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné tumory nebo léze, nebo léze, které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.
Všechny orgány a tkáně by měly být uchovány pro histopatologické vyšetření. To se obvykle týká následujících orgánů a tkání: mozku 3) (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsku mozkového, štítné žlázy a příštítných tělísek, thymu, trachey a plic, srdce, aorty, slinných žláz, jater 3), sleziny, ledvin 3), nadledvinek 3), jícnu, žaludku, dvanácterníku, jejuna, ilea, slepého střeva, tračníku, konečníku, močového měchýře, lymfatických uzlin, slinivky, gonád 3), akcesorních pohlavních orgánů, samičí mléčné žlázy, kůže, svaloviny, periferního nervu, míchy (krční, hrudní a bederní), sterna s kostní dření a stehenní kosti včetně kloubů, a očí. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích, je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.
Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k disposici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.
------------------------------------------------------------------
3) tyto orgány z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu u hlodavců a ze všech nehlodavců, a dále štítná žláza (s příštítnými tělísky) ze všech nehlodavců, mají být zváženy
1.2.3.6 Histopatologie
Všechny viditelné změny, zvláště tumory a jiné léze vyskytující se v kterémkoli orgánu, mají být zkoumány mikroskopicky. Navíc jsou doporučeny následující postupy:
(a) mikroskopické vyšetření všech uchovaných orgánů a tkání s kompletním popisem všech lézí nalezených:
1. u všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během studie,
2. u všech zvířat ze skupiny s vysokou dávkou a kontrolní skupiny
(b) orgány či tkáně ukazující abnormity způsobené nebo pravděpodobně způsobené testovanou látkou jsou zkoumány také ve skupinách s nižšími dávkami.
(c) tam, kde výsledky svědčí pro významné zkrácení normální délky života zvířat nebo vyvolání účinků, které by mohly ovlivnit toxickou odpověď, skupina s nejblíže nižší dávkou se vyšetří popsaným způsobem.
(d) informace o incidenci lézí, které se normálně vyskytují v použitém kmeni zvířat, ve stejných laboratorních podmínkách, t.j. historické kontrolní údaje, jsou nezbytné pro správné posouzení významnosti změn pozorovaných u zvířat s aplikovanou látkou.