1. Metoda
1.1 Princip testovací metody
Testovaná látka se podává denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat orálně, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Pitva se provede u všech zvířat, která uhynou nebo jsou utracena během pokusu; také zvířata, která přežijí konec pokusu, se utratí a pitvají.
1.2 Popis metody
1.2.1 Příprava
Zdravá mladá zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní skupiny a jednotlivých experimentálních skupin. Klece jsou uspořádány tak, aby se co nejvíce vyloučil vliv umístění klece. Každé jednotlivé zvíře je jednoznačně označeno. Nejméně 5 dní před začátkem studie jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu.
Testovanou látku lze podávat sondou nebo v potravě nebo v pitné vodě, podle účelu studie a fyzikálně-chemických vlastností látky.
Pokud je to třeba, rozpustí nebo suspenduje se testovaná látka ve vhodném nosiči (vehikulu). Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku/suspenze, pak použití roztoku/emulze v jedlém oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiných nosičích. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika; pokud není známa, musí být stanovena ještě před testem. Je nezbytné ověřit stabilitu látky v zvoleném vehikulu.
1.2.2 Experimentální podmínky
1.2.2.1 Pokusná zvířata
Dává se přednost potkanům, ale je možno použít i jiného druhu hlodavců. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Podávání látky by mělo začít co nejdříve po odstavu a v každém případě dříve než zvířata dosáhnou věku 9 týdnů.
Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.
Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít zvířata stejného kmene a ze stejného zdroje.
1.2.2.2 Počet a pohlaví
Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie. je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu.
Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po podávání sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).
1.2.2.3 Volba dávek
Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám. a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.
Pokud se podle dostupných informací nedá očekávat účinek při denní dávce 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti, je možno provést limitní test. Nejsou-li taková data k dispozici, lze provést předběžnou vyhledávací studii za účelem stanovení dávek.
Při výběru dávek je třeba vzít v úvahu všechny existující údaje z toxikologických a toxikokinetických studií o testované látce případně látkách příbuzných.
Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí ani velké utrpění. Dále se vyberou dávky v klesající řadě tak, aby umožnily prokázat závislost účinku na dávce. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity (NOAEL). Obvykle je vhodný dvoj- až čtyřnásobný odstup mezi sousedními dávkami; pokud je potřeba pokrýt větší rozsah dávek, je lepší přidat čtvrtou dávkovou skupinu, než zvolit příliš velký odstup mezi dávkami (např. faktor větší než 10).
Pokud se testovaná látka podává v potravě nebo pitné vodě, je důležité zajistit, aby podávané množství látky neovlivňovalo výživu a vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm) nebo konstatní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.
Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít stejné potravy.
1.2.2.4 Limitní test
Neprokáže-li test provedený zde popisovaným způsobem žádné toxické účinky při dávce 1000 mg.kg-1 tělesné hmotnosti za den nebo při takové koncentraci v potravě nebo vodě, která této dávce odpovídá, a pokud toxicita testované látky nevyplývá z analogie s příbuznými látkami, je možno od provedení kompletního testování při třech dávkových úrovních upustit. Toto pravidlo limitního testu platí, pokud údaje o expozici lidí nenaznačují, že je třeba testovat při vyšších dávkách.
1.2.2.5 Doba pozorování
Doba pozorování je 28 dní. Zvířata satelitní skupiny jsou pozorována nejméně dalších 14 dnů bez aplikace s cílem zachytit případné zpožděné účinky a pro posouzení přetrvávání nebo vratnosti účinku.
1.2.3 Popis postupu
Zvířatům se podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 28 dnů, ve zdůvodněných případech 5 dní v týdnu. Denní dávka se podává jednorázově žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou. Maximální objem tekutiny, který může být podán najednou, závisí na velikosti zvířete. Objem by neměl normálně přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků lze podat i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu je třeba minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl podáván týž objem na všech úrovních dávky. Neplatí to u látek dráždivých a leptavých, u kterých je třeba obvykle počítat se stupňovanými účinky při vyšších koncentracích.
1.2.3.1 Všeobecné pozorování
Všeobecné klinické pozorování se provádí nejméně jednou denně, nejlépe v tutéž denní dobu a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po aplikaci. Zaznamenává se zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede zběžná prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Zvířata moribundní a zvířata projevující silnou bolest nebo stres jsou vyřazena, utracena humánním způsobem a pitvána.
Důkladné klinické vyšetření všech zvířat se provede před první aplikací (za účelem intraindividuálního porovnání) a dále nejméně jednou týdně. Toto pozorování se děje mimo chovnou klec v standardním pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou denní dobu. Výsledky pozorování se pečlivě zaznamenávají, nejlépe s použitím skórovacího systému, standardizovaného v testující laboratoři. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily co nejméně; osoba, provádějící pozorování, by nejlépe neměla znát příslušnost zvířat do dávkových skupin.
Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů, změny dýchání a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic) a případně další. Zaznamenávají se změny chůze, polohy, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (vytrvalé čisticí pohyby nebo kroužení) nebo bizarních vzorců chování (např. sebepoškozování, pohyb pozadu)-
Ve čtvrtém týdnu aplikace se otestují reakce na různé senzorické podněty (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní), změří se síla úchopu a celková motorická aktivita. Další podrobné informace o postupech, které je možno k testování použít, jsou uvedeny v literatuře (viz Všeobecný úvod, část B).
Pozorování funkčních poruch ve čtvrtém týdnu aplikace lze případně vynechat, pokud 28-denní studie slouží jako předběžná studie pro následující studii subchronickou (90-denní); v tom případě je pozorování funkčních poruch zařazeno do této dlouhodobé studie. Ovšem i v tomto případě jsou údaje o funkčních poruchách ve čtvrtém týdnu 28-denní studie vhodným východiskem pro výběr dávek pro subchronickou studii.
Výjimečně lze vynechat pozorování funkčních poruch u skupin vykazujících takové příznaky toxicity, které by při posuzování funkčního stavu zvířete vadily.
1.2.3.2 Tělesná hmotnost a příjem potravy a vody
Zvířata se váží nejméně jednou týdně. Spotřeba potravy a vody se měří nejméně jednou týdně, také v případě aplikace v pitné vodě.
1.2.3.3 Hematologie
Hematologické vyšetření na konci pokusu zahrnuje stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů, počtu trombocytů a změření srážlivosti krve.
Krev se odebere těsně před nebo v průběhu utracení zvířete, místo odkud se krev odebrala se zaznamená. Krev se skladuje za vhodných podmínek.
1.2.3.4 Biochemická analýza
Biochemická analýza krve za účelem posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na játra a ledviny, se provede u všech zvířat těsně před nebo v průběhu utracení (kromě zvířat uhynulých nebo utracených během pokusu). Doporučuje se nechat zvířata bez potravy přes noc před odběrem krve 1). Vyšetření plazmy a sera zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových proteinů, albuminu, aktivity alespoň dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky (jako alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gama glutamyltranspeptidáza, sorbitoldehydrogenáza). Změření dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může v některých případech poskytnout užitečné informace.
Další možnost je časově definovaný sběr a vyšetření moči během posledního týdne studie: hodnotit je možno vzhled, objem, osmolalitu nebo specifickou hmotnost, pH, bílkoviny, glukózu a krev příp. krvinky.
Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání v séru.
Další charakteristiky je třeba stanovit u látek známých nebo podezřelých z působení na určité metabolické funkce: stanovení vápníku, fosforu, triglyceridů na lačno, lipidů, specifických hormonů, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.
Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované nebo očekávané účinky dané látky.
Pokud nejsou k dispozici údaje o normálních hodnotách některých hematologických nebo biochemických proměnných, je třeba uvážit jejich stanovení ještě před začátkem studie.
------------------------------------------------------------------
1) Vyšetření na lačno je žádoucí pro řadu měření v séru a plazmě, zvláště pro glukózu. Hlavní důvod pro toto doporučení je to, že u nehladovějících zvířat je vyšší variabilita výsledků, která by mohla maskovat jemné změny a ztížit interpretaci. Na druhé straně, hladovění přes noc by mohlo mít vliv na celkový metabolismus a u aplikace v potravě by zasáhla do pravidelnosti expozice testované látce. Pokud se odebírá krev na lačno, je třeba biochemické vyšetření provést až po pozorování funkčních poruch ve 4. týdnu testu.
1.2.3.5 Pitva
U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů, dutiny lební, hrudní a břišní, a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat se řádně očistí od ulpěných tkání a co nejdříve po sekci se zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.
Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými změnami, mozek (reprezentativní oblasti včetně hemisfér, mozečku a mostu), míchu, žaludek, tenké i tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, slezinu, srdce, brzlík, štítnou žlázu, průdušnici a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a pak ponořením), gonády a přídatné pohlavní orgány (např. dělohu, prostatu), močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis), nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně). Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zvolit i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba uchovat.
1.2.3.6 Histopatologická vyšetření
U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.
Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.
U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.