1. Metoda
1.1 Princip testovací metody
Testovaná látka se podává několika skupinám samic a samců v odstupňovaných dávkách.
Samci rodičovské (P) generace dostávají testovanou látku v době růstu a alespoň v průběhu jednoho spermatogenního cyklu (přibližně 56 dnů u myší a 70 dnů u potkanů), aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na spermatogenezu.
Samice rodičovské generace (P) dostávají látku po dobu alespoň dvou estrálních cyklů, aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na estrus.
Zvířata jsou poté připuštěna. V době připouštění se testovaná látka podává zvířatům obou pohlaví a potom, v době gravidity a kojení, pouze samicím. Po odstavení je látka podávána zvířatům filiální generace F1 v průběhu růstu do dospělosti, v době páření a až do doby odstavení F2 generace.
Pro inhalační aplikaci je třeba metodu modifikovat.
1.2 Popis testovací metody
1.2.1 Příprava
Před zahájením testu jsou zdravá zvířata náhodně rozdělena do dvou skupin - kontrolní a exponované skupiny. Rodičovská zvířata (P) jsou chována nejméně 5 dnů před zahájením pokusu v těch podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Doporučuje se testovanou látku podávat v potravě nebo v pitné vodě. Jiné způsoby podání jsou také možné. Všechna zvířata látku dostávají stejným způsobem v průběhu celého testu. Pokud se používá k usnadnění aplikace vehikulum nebo jiné aditivum, musí být o nich známo, že nemají toxické účinky. Látka se aplikuje 7 dní v týdnu.
1.2.2 Pokusná zvířata
Dává se přednost potkanům nebo myším. Používají se zdravá P zvířata, do té doby nepoužitá pro jiné experimenty. Nepoužívá se kmenů s nízkou plodností. Musí být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví a váhy nebo věku. Plodnost musí být ověřena u obou pohlaví. Zvířata v obou skupinách, exponované a kontrolní, musí být odstavena před zahájením aplikace.
1.2.3 Počet a pohlaví
Každá exponovaná i kontrolní skupina musí mít dostatečný počet zvířat, aby bylo zaručeno cca 20 březích samic s přibližně stejným termínem porodu. Cílem je získat dostatečný počet těhotenství a potomstva, a tím zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, průběh gravidity a mateřské chování, kojení, růst a vývoj potomstva generace F1 od početí do dospělosti, a vývoj jejich potomstva generace F2 až do odstavení.
1.2.4 Podmínky testu
Vodu a potravu dostávají zvířata ad libitum. Před porodem se těhotné samice přemístí do zvláštních porodních nebo mateřských klecí a je jim poskytnut materiál pro vytvoření hnízda.
1.2.5 Dávkování
Použijí se alespoň tři exponované skupiny a jedna kontrolní. Pokud se používá pro aplikaci testované látky vehikulum, pak zvířata kontrolní skupiny dostávají vehikulum v největším použitém objemu. Pokud testovaná látka snižuje příjem a utilizaci potravy, je třeba uvážit použití další kontrolní skupiny, spárované co do výživy.
Testovaná látka v nejvyšší koncentraci má v ideálním případě, pokud to dovolí fyzikálně-chemické vlastnosti látky a její biologické účinky, vyvolávat toxicitu a nikoli mortalitu v rodičovské populaci. Střední dávka(y) by měla(y) vyvolat minimální toxické účinky, které by se daly připsat testované látce, a nejnižší dávka by neměla vyvolávat žádné pozorovatelné nepříznivé účinky ani u rodičů ani u potomstva.
Při podání sondou nebo v tobolkách se dávka stanoví na základě individuální hmotnosti zvířete a přizpůsobuje se každý týden podle změny hmotnosti. V případě těhotných samic, dávky mohou být případně určeny na základě tělesné hmotnosti v 0. nebo 6. dni od začátku těhotenství.
1.2.6 Limitní test
V případě látek s nízkou toxicitou, pokud se ani dávka 1000 mg.kg-1 neprojevuje žádným toxickým účinkem na reprodukci, nemusí se provádět studie na jiných dávkových úrovních. Pokud předběžná studie ukáže, že vysoká dávka, vyvolávající jasnou mateřskou toxicitu, nemá nepříznivé účinky na plodnost, není nutné provádět studie na jiných dávkových úrovních.
1.3 Popis postupu
1.3.1 Plán pokusu
Denní aplikace samcům rodičovské generace P začne ve věku pěti až devíti týdnů, aspoň po pětidenní aklimatizaci po odstavení. U potkanů aplikace pokračuje deset týdnů před obdobím připouštění (8 týdnů pro myši). Samci se buď utratí a vyšetří na konci období připouštění nebo se pokračuje v aplikaci a jsou použiti pro případnou produkci dalších vrhů a jsou utraceni a vyšetřeni někdy před koncem pokusu.
Denní aplikace samicím rodičovské generace P začne po pětidenní aklimatizaci a pokračuje aspoň dva týdny před obdobím připouštění. Denní aplikace pokračuje pak po celé tři týdny období připouštění, v době gravidity až do odstavení F1 potomstva. Je přípustná změna dávkovacího plánu podle znalostí o vlastnostech studované látky, např. o indukci metabolismu resp. o bioakumulaci.
Aplikace zvířatům generace F1 začíná po odstavu a končí jejich utracením.
1.3.2 Postup při připouštění
Je možno použít párování 1 : 1 (jedna samice a jeden samec) anebo 1 : 2 (jeden samec ke dvěma samicím).
V případě 1 : 1 párovaní, samice se ponechá s týmž samcem ve společné kleci do otěhotnění anebo po dobu 3 týdnů. Každé ráno jsou samice vyšetřeny na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 těhotenství je definován jako den nálezu vaginální zátky nebo spermatu.
Vzhledem k vývoji spermiogenese, zvířata generace F1 se nepoužívají pro připouštění do věku 11 týdnů u myší a 13 týdnů u potkanů. Pro připouštění zvířat generace F1 se náhodně vyberou páry z různých vrhů téže dávkové skupiny. Zvířata nepoužitá se utratí po odstavu.
Dvojice, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit s cílem zjistit důvod neplodnosti páru. To je možné buď poskytnutím další příležitosti k oplodnění s osvědčenými jedinci obou pohlaví nebo mikroskopickým vyšetřením reprodukčních orgánů nebo vyšetřením estrálního cyklu a spermatogenezy.
1.3.3 Velikost vrhů
Zvířatům použitým pro vyšetření plodnosti je ponechána možnost porodit normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez standardizace velikosti vrhů. Pokud se velikost vrhů standardizuje, je třeba dodržet následující postup: mezi 1. a 4. dnem po porodu se velikost všech vrhů upraví vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby se dosáhlo počtu 4 samců a 4 samic na vrh; pokud to není proveditelné, je možno standardizovat na jiné počty, např. 5 samců a 3 samice. Vrhy menší než 8 nelze standardizovat. Standardizace vrhů generace F2 se provede obdobně.
1.3.4 Pozorování
Každé zvíře má být pozorováno alespoň jednou za den. Významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého porodu a všechny příznaky toxicity, včetně mortality, se zaznamenávají. Příjem potravy se měří týdně jak před, tak během doby připouštění. Během gravidity je vhodné kontrolovat příjem potravy denně. Po porodu a v průběhu laktace se měří příjem potravy ve stejný den, kdy je potomstvo váženo. Rodičovská P a F1 zvířata se váží první den aplikace a pak týdně. Všechna pozorování se zaznamenávají individuálně pro každé dospělé zvíře.
Doba gestace se počítá od dne 0 těhotenství. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvých a živých porodů a přítomnost hrubých anomalií.
Mrtvá mláďata a mláďata utracená ve čtvrtém dnu se uchovají pro vyšetření na možné defekty. Živá mláďata se spočítají a celé vrhy se zváží ráno po porodu, ve 4. a 7. dnu a potom každý týden do ukončení studie, kdy jsou zvířata zvážena individuálně. Pozorují se a zaznamenávají všechny abnormality v chování a fyzickém stavu matek a potomstva.
1.3.5 Patologie
1.3.5.1 Pitva
Všechna dospělá zvířata generací P a F1 se utrácejí, jakmile není nutné je déle uchovávat pro posouzení účinků látky na reprodukci. Zvířata generace F1 nevybraná pro připouštění a všechna zvířata generace F2 se utratí po odstavení.
Po utracení nebo úmrtí se všechna rodičovská zvířata P a F1 makroskopicky vyšetří na strukturní abnormality anebo patologické změny, se zvláštní pozorností k orgánům reprodukčního systému. Mláďata uhynulá nebo moribundní se vyšetří na defekty.
1.3.5.2 Histopatologické vyšetření
Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagina, varlata, epididymis, semenné kanálky, koagulační žlázka, prostata, hypofysa a další cílové orgány všech zvířat generací P a F1 se uchovají pro mikroskopické vyšetření. V případě, že tyto orgány nebyly doposud vyšetřeny v jiných mnohadávkových studiích, provede se mikroskopické vyšetření u všech P a F1 zvířat kontrolní skupiny a skupiny dostávající nejvyšší dávku, která byla vybrána pro připouštění, a dále u zvířat, která zemřela v průběhu pokusu. Orgány, které jevily abnormality u těchto skupin zvířat, se vyšetří i u zvířat ostatních dávkových skupin. V těchto případech se mikroskopicky vyšetřují všechny tkáně makroskopicky postižené. Jak již bylo uvedeno, reprodukční orgány zvířat podezřelých z neplodností se mají též podrobit mikroskopické analyze.