1. Metoda
1.1 Princip testu
Cílem kombinovaného testu chronické toxicity/karcinogenity je určit chronické a karcinogenní účinky látky u některého druhu savců po dlouhodobé exposici.
Pro tento účel je test karcinogenity doplněn alespoň jednou exponovanou satelitní skupinou a kontrolní satelitní skupinou. Dávka použitá pro tuto satelitní skupinu může být vyšší než nejvyšší dávka použitá při testu karcinogenity. Zvířata v testu karcinogenity jsou zkoumána jak na obecnou toxicitu, tak na karcinogenní odpověď. Zvířata v exponované satelitní skupině jsou testována na obecnou toxicitu.
Testovaná látka se podává obvykle sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity a vývoje tumorů.
1.2 Popis metody
Zvířata se chovají v pokusných podmínkách ustájení a krmení nejméně pět dní před započetím testu. Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.
1.2.1 Experimentální zvířata
Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20 % od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.
1.2.2 Počet a pohlaví
Pro hlodavce se použije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) na každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty se zvýší o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.
Exponovaná satelitní skupina (skupiny) pro hodnocení patologie jiné než jsou tumory by každá měla obsahovat 20 zvířat pro každé pohlaví, zatímco satelitní skupina kontrol by měla obsahovat 10 zvířat každého pohlaví.
1.2.3 Dávkové úrovně a frekvence exposic.
Pro test karcinogenity se zvolí přinejmenším tři dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10 %), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory. Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10 % vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.
Při volbě dávkových úrovní by se měly vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.
Pro účely testování chronické toxicity jsou v testu zahrnuty satelitní exponované skupiny a souběžná kontrolní satelitní skupina. Vysoká dávka pro exponovaná satelitní zvířata by měla vyvolat zřetelné příznaky toxicity.
Exposice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.
1.2.4 Kontroly
Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu s exponovanou skupinou, vyjma exposice testované látce.
Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.
1.2.5 Způsob aplikace
Tři hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobnému způsobu exposice u člověka.
1.2.5.1 Orální studie
Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.
Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dní v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat "abstinenční" příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.
1.2.5.2 Dermální studie
Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.
1.2.5.3 Inhalační studie
Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.
Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dní v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.
Volba přerušované nebo kontinuální exposice závisí na cílech studie a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.
Exposiční komory
Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnout 5 % objemu komory.
Měření nebo monitorování zahrnuje:
(a) průtok vzduchu: rychlost průtoku vzduchu komorou by měla být nejlépe kontrolována kontinuálně,
(b) koncentrace: během denní exposice by koncentrace testované látky neměla kolísat více než ± 15 % střední hodnoty,
(c) teplota a vlhkost: pro hlodavce, teplota by měla být udržována v rozmezí 22 ± 2° C a vlhkost v komorách 30 - 70 % vyjma případů, kdy je voda používána k rozptýlení testované látky v atmosféře komory. Oba parametry by měly být kontrolovány průběžně,
(d) měření velikosti částic: měla by být stanovena distribuce velikosti částic v atmosféře komor u tekutých nebo pevných aerosolů. Aerosolové částice by měly být v respirabilní velikosti pro použité testovací zvíře. Vzorky atmosféry komor se odebírají z dýchací zóny zvířat. Vzorek vzduchu by měl být representativní pro distribuci částic, kterým je zvíře exponováno, a měl by gravimetricky odpovídat celému suspendovanému aerosolu, i když značná část aerosolu není respirabilní. Analýza velikosti částic by měla být prováděna často během vývoje generujícího systému, aby zajistila stabilitu aerosolu, a poté během exposic tak často, aby bylo možno posoudit stabilitu distribuce částic, kterým jsou zvířata exponována.
1.2.6 Trvání studie
Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířete použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života resp. s nízkým spontánním výskytem tumorů, doba ukončení by měla být 24 měsíců pro myši a křečky a 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, každé pohlaví se posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10 % a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50 % v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.
Satelitní skupiny 20 dávkovaných zvířat pro každé pohlaví a 10 připojených kontrolních zvířat každého pohlaví použitých pro testování chronické toxicity by měly být v pokusu aspoň 12 měsíců. U těchto zvířat by mělo být plánováno utracení tak, aby umožnilo odlišení patologie, která má vztah k testované látce, od komplikujících projevů stárnutí.
1.3 Popis postupu
1.3.1 Pozorování
Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.
U zvířat exponované satelitní skupiny (skupin) se provádí v přiměřených intervalech klinické vyšetření.
Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Moribundní zvířata by měla být utracena a pitvána.
Klinické příznaky včetně neurologických a očních nálezů a mortalita se zaznamenávají u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.
Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.
Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.
1.3.2 Klinická vyšetření
1.3.2.1 Hematologie
Hematologická vyšetření (např. obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erythrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo další měření srážlivosti) by měla být prováděna za tři měsíce, šest měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od týchž potkanů.
Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.
Diferenciální obraz bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.
1.3.2.2 Analýza moči
Vzorky moči od 10 potkanů od každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:
- vzhled moči, objem a hustota u jednotlivých zvířat,
- proteiny, glukosa, ketolátky, okultní krvácení (semi-kvantitativně),
- mikroskopické vyšetření sedimentu (semi-kvantitativně).
1.3.2.3 Biochemické vyšetření
V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:
- celková koncentrace proteinů,
- koncentrace albuminu,
- testy na funkci jater (např. aktivita bázické fosfatázy, aktivita glutamát pyruvát transaminasy 1), glutamát acetát transaminasy 2), gamma glutamyl transpeptidasy, ornithin dekarboxylasy,
- metabolismus cukrů, např. krevní glukosa na lačno,
- test na funkci ledvin, např. dusík močoviny v krvi.
------------------------------------------------------------------
1) nyní známá jako sérová alanin aminotransferasa
2) nyní známá jako sérová aspartát aminotransferasa
1.3.2.4 Makroskopické patologické vyšetření
Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v moribundním stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné léze, tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mirkoskopickými nálezy.
Všechny orgány a tkáně by měly být uchovány pro histopatologické vyšetření. To se obvykle týká následujících orgánů a tkání: mozku 3) (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsku mozkového, štítné žlázy a příštítných tělísek, thymu, trachey a plic, srdce, aorty, slinných žláz, jater 3), sleziny, ledvin 3), nadledvinek 3), jícnu, žaludku, dvanácterníku, jejuna, ilea, slepého střeva, tračníku, konečníku, močového měchýře, lymfatických uzlin, slinivky, gonád 3), akcesorních pohlavních orgánů, samičí mléčné žlázy, kůže, svaloviny, periferního nervu, míchy (krční, hrudní a bederní), sterna s kostní dření a stehenní kosti včetně kloubů, a očí. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích, jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.
Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k disposici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.
------------------------------------------------------------------
3) Tyto orgány z 10 zvířat na pohlaví a na skupinu hlodavců mají být zváženy.
1.3.2.5 Histopatologie
Pro testování chronické toxicity:
Podrobné vyšetření se provede ve všech uchovaných orgánech všech zvířat satelitní skupiny s vysokou dávkou a satelitní kontrolní skupiny. Pokud se v satelitní skupině exponované nejvyšší dávce najdou patologické změny způsobené látkou, vyšetří se histologicky cílové orgány všech ostatních zvířat z ostatních exponovaných satelitních skupin i ze všech exponovaných skupin části studie věnované karcinogenitě při jejím ukončení.
Pro testování karcinogenity:
(a) úplná histopatologie se provede v orgánech a tkáních všech zvířat, která uhynula nebo byla utracena během testu a u všech zvířat skupiny kontrolní a s nejvyšší dávkou;
(b) všechny tumory viditelné okem a léze, které jsou podezřelé jako tumory, se vyšetří mikroskopicky u všech skupin;
(c) je-li významný rozdíl v incidenci neoplastických lézí mezi skupinou s vysokou dávkou a kontrolní skupinou, histopatologické vyšetření se provede v daném orgánu či tkáni i v dalších skupinách;
(d) je-li přežití ve skupině s vysokou dávkou podstatně nižší než u kontrol, měla by být kompletně zkoumána i skupina s nejbližší nižší dávkou;
(e) je-li ve skupině s vysokou dávkou doklad o vyvolání toxických nebo jiných účinků, které by mohly ovlivnit neoplastickou odpověď, je třeba kompletně vyšetřit nejblíže nižší dávkovou úroveň.