1. Metoda
1.1 Princip metody
Test na recesivní letální mutace vázané na pohlaví (SLRL) na Drosophila melanogaster umožňuje detekci mutací, jak genových, tak i malých delecí, v zárodečných buňkách hmyzu. Je to test na forward mutace vhodný pro skríning mutací v přibližně 800 lokusech chromozómu X. Tyto representují asi 80 % všech lokusů X-chromozómu. X-chromozóm representuje přibližně 1/5 celého haploidního genómu.
Mutace v X-chromozómu se fenotypicky projeví u samců nesoucích mutovaný gen. Když je mutace letální v hemizygotním stavu lze na její přítomnost usuzovat z absence jednoho ze dvou typů samčích potomků, kteří se normálně rodí heterozygotní samici. SRLS test je výhodný vzhledem k zvláštnímu vzhledu a uspořádání chromozómů.
1.2 Popis metody
1.2.1 Příprava
1.2.1.1 Zdroje
Používají se samci dobře definované divoké linie a samice linie Muller-5. Mohou být použity i jiné vhodné dobře popsané linie samic s vícenásobnou inversí X-chromozómu.
1.2.1.2 Testované látky
Testované látky se rozpouštějí ve vodě. Látky ve vodě nerozpustné se rozpouštějí, nebo suspendují ve vhodném rozpouštědle (např. směs etanolu a Tweenu-60, nebo 80), před aplikací se dále ředí vodou, nebo fyziologickým roztokem. Doporučuje se nepoužívat dimetylsulfoxid (DMSO) jako vehikulum.
1.2.1.3 Počet zvířat
Test má předem určenou citlivost. Spontánní frekvence mutací v kontrolní skupině významně ovlivňuje nutný počet ovlivněných chromozómů, které je třeba analyzovat.
1.2.1.4 Způsob aplikace
Expozice testované látce se uskutečňuje per os, injekčně, nebo expozicí plynům nebo parám. Zkrmování testované látky se provádí v cukerném roztoku. Je-li to nutné, testovaná látka se rozpustí v 0,7 % roztoku NaCl a injikuje se do hrudní nebo břišní dutiny.
1.2.1.5 Negativní a positivní kontroly
V každém pokusu se zařazují negativní (s rozpouštědlem) a positivní kontroly. Jestliže má laboratoř k dispozici vhodné historické kontrolní údaje, není třeba zařazovat do experimentu souběžné kontroly.
1.2.1.6 Dávkování
Používají se tři dávky testované látky. Pro předběžný orientační odhad se používá jedna dávka rovnající se maximální tolerované koncentraci, nebo vyvolávající známky toxicity. Netoxické látky se testují v nejvyšší dosažitelné dávce.
1.2.2 Popis postupu
Samci divokého typu (ve stáří 3-5 dnů) jsou ovlivněni testovanou látkou a individuálně kříženi s virginními samicemi z linie Muller-5 nebo z jiné vhodné markerové linie (vícenásobná inverse X-chromozómu). Samice jsou vyměněny za čerstvé virginní samice každé dva až tři dny aby byl pokryt celý buněčný cyklus zárodečných buněk. U potomků těchto samic je sledován letální efekt korespondující s účinkem testované látky v době expozice na zralé spermie, na spermatidy ve středním, nebo pozdním stádiu, časné spermitidy, spermatocyty a spermatogonie.
Heterozygotní F1 samice narozené z tohoto křížení jsou dále kříženy individuálně (t. j. jedna samice/zkumavku) se svými bratry. V F2 generaci je v každé kultuře zaznamenávána absence samců divokého typu. Jestliže v kultuře vznikají F1 samice nesoucí letální mutaci v rodičovském X-chromozómu (nejsou nalezeni žádní samci s ovlivněným chromozómem), dcery těchto samic se stejným genotypem jsou dále testovány aby se zjistilo, zda letalita se opakuje v dalších generacích.