1. Metoda
1.1 Princip metody
Mitotická rekombinace u Saccharomyces cerevisiae může být detekována mezi geny (obecněji mezi genem a jeho centromerou) a uvnitř genů. První případ je nazývá mitotické překřížení a vytváří reciproční produkty, kdežto druhý případ je většinou nereciproční a je nazýván genová konverse. Překřížení je obecně testováno na základě tvorby recesivních homozygotních kolonií nebo sektorů vzniklých u heterozygotních kmenů, genová konverse je testována na základě tvorby prototrofních revertant vzniklých a auxotrofního heteroalelického kmene, který nese dvě různé defektní alely téhož genu. Nejčastěji užívané kmeny pro detekci mitotické genové konverse jdou D4 (heteroalelický v ade 2 a trp 5), D7 (heteroalelický v trp 5), BZ34 (heteroalelický v arg 4) a JD1 (heteroalelický v his 4 a trp 5). Mitotické překřížení produkující červené a růžové sektory může být testováno u D5 nebo D7 (který rovněž měří mitotickou genovou konversi a reversní mutace v ilv 1-92). Oba kmeny jsou heteroalelické pro komplementární alely ade 2.
1.2 Popis metody
1.2.1 Příprava
Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnosti a charakteristiky růstu.
Metabolická aktivace
Buňky mají být vystaveny působení testovaných látek jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného exogenního metabolického aktivačního systému. Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.
1.2.2 Experimentální podmínky
1.2.2.1 Testovací kmeny
Nejužívanější jsou diploidní kmeny D4, D5, D7 a JD1. Užití jiných kmenů může být rovněž vhodné.
1.2.2.2 Média
Odpovídající kultivační média jsou užívána pro určení přežívajících buněk a frekvenci mitotické rekombinace.
1.2.2.3 Negativní a pozitivní kontroly
Pozitivní, neovlivněné a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající pozitivní kontrolní chemické látky.
1.2.2.4 Koncentrace
Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. Musí být brán ohled na cytotoxicitu a rozpustnost. Nejnižší koncentrace nesmí mít vliv na životnost buněk. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.
Buňky mohou být vystaveny působení testované látky buď ve stacionární fázi nebo během růstu po dobu až 18 h. Kultury dlouhodobě ovlivňované mají být mikroskopicky kontrolovány pro tvorbu spor, jejichž přítomnost test znehodnocuje.
1.2.2.5 Podmínky inkubace
Misky jsou inkubovány ve tmě po čtyři až sedm dní při 28 - 30 °C. Misky použité pro průkaz červených a růžových sektorů tvořených mitotickým překřížením mají být umístěny v chladničce (cca 4 °C) po další 1 - 2 dny před počítáním, aby se mohly utvořit odpovídající pigmentované kolonie.
1.2.2.6 Spontánní frekvence mitotické rekombinace
Mají být užity subkultury s frekvencí spontánních mutací v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.
1.2.2.7 Počet replikací
Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu prototrofních buněk tvořených mitotickou genovou konversí a pro určení životnosti buněk. V případě testování recesivní homozygosity tvořené mitotickým překřížením má být počet misek zvýšen, aby bylo dosaženo dostatečného počtu kolonií.
1.2.2.8 Postup
Ovlivnění S. cerevisiae probíhá obvykle jako zkumavkový test v tekutém
prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy
7
mají být provedeny na rostoucích buňkách. 1-5 x 10 buněk/ml je vystaveno
testované látce po dobu až 18 h při 28 až 30 °C za třepání. Odpovídající
množství metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění,
pokud je to potřebné.
Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající buňky a buňky s indukcí mitotické rekombinace.
Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus pozitivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.