1. Metoda
1.1 Princip metody
Různé haploidní a diploidní kmeny kvasinek Saccharomyces cerevisiae mohou být užity pro určení produkce genových mutací indukovaných chemickými látkami bez a s metabolickou aktivací.
Jsou využívány forward mutační systémy u haploidních kmenů, jako je míra vzniku mutací z červených, adenin vyžadujících mutant (ade-1, ade-2) na dvojité, adenin vyžadující bílé mutanty a selektivní systémy, jako je indukce resistence ke canavaninu a cykloheximidu.
Nejlépe ověřený reversní mutační systém zahrnuje využití haploidního kmene XV 185-14C s okrovými (ochre) nonsense mutacemi ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 a trp 5-48. Mutace jsou vratné působením mutagenů typu záměny bazí, které indukují mutace ve specifickém místě, nebo okrové supresorové mutace. XV 185-14C nese rovněž his 1-7 marker, missense mutaci, revertovanou převážně mutacemi v dalším místě a marker hom 3-10, který je revertován posunovými mutageny.
U diploidních kmenů S. cerevisiae je jediným široce využívaným kmenem D7, který je homozygotní pro ilv 1-92.
1.2 Popis metody
1.2.1 Příprava
Roztoky testovaných látek a kontrol mají být připraveny těsně před testováním za použití vhodného vehikula. U organických látek ve vodě nerozpustných se nemá užít roztok vyšší než 2 objemová % v organických rozpouštědlech jako je etanol, aceton nebo dimetylsulfoxid (DMSO). Finální koncentrace vehikula nemá významně ovlivnit životnost a charakteristiky růstu.
Metabolická aktivace
Buňky mají být exponovány testovaným látkám jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému.
Nejčastěji užívaným systémem je postmitochondriální frakce připravená z jater hlodavců po aplikaci látek indukujících enzymy a doplněná kofaktory. Užití jiných druhů, tkání, postmitochondriálních frakcí či postupů může být rovněž vhodné pro metabolickou aktivaci.
1.2.2 Experimentální podmínky
1.2.2.1 Testovací kmeny
Haploidní kmen XV 185-14C a diploidní kmen D7 jsou nejužívanější pro studie genových mutací. Jiné kmeny mohou být rovněž vhodné.
1.2.2.2 Média
Odpovídající kultivační média jsou užívána pro určení počtu přežívajících a mutovaných buněk.
1.2.2.3 Negativní a pozitivní kontroly
Pozitivní, neovlivnění a rozpouštědlem ovlivněné kontroly jsou používány současně. Pro každou specifickou mutační změnu mají být použity odpovídající pozitivní kontrolní chemické látky.
1.2.2.4 Koncentrace
Má být použito nejméně 5 vhodně zvolených koncentrací. U toxických látek nemá nejvyšší použitá koncentrace redukovat přežití pod 5 - 10 %. Látky ve vodě relativně nerozpustné mají být testovány až po mez rozpustnosti látky za použití vhodných postupů. Nejvyšší koncentrace pro látky netoxické, ve vodě rozpustné, je určena případ od případu.
1.2.2.5 Kultivační podmínky
Misky jsou inkubovány po sedm dní při 28 až 30 °C ve tmě.
1.2.2.6 Frekvence spontánních mutací
Frekvence spontánních mutací u subkultur má být v rozmezí akceptovaných normálních hodnot.
1.2.2.7 Počet replikací
Je nutno použít nejméně tří misek na jednu koncentraci u testu s prototrofními buňkami a u životnosti buněk. U experimentů užívajících markery jako hom 3-10 s nízkou mutační rychlostí musí být počet misek zvýšen, aby byly získány statisticky relevantní údaje.
1.2.3 Popis postupu
Ovlivnění kmenů S. cerevisiae je obvykle prováděno ve zkumavce v tekutém
prostředí a zahrnuje buď stacionární nebo rostoucí buňky. Základní pokusy mají
7
být provedeny na rostoucích buňkách: 1-5 x 10 buněk/ml je vystaveno testované
látce po dobu až 18 h při 28 až 30 °C za třepání. Odpovídající množství
metabolického aktivačního systému je přidáno v průběhu ovlivnění, pokud je to
potřebné. Po skončení ovlivnění jsou buňky centrifugovány, promyty a
vyočkovány na vhodné kultivační medium. Po inkubaci jsou počítány přežívající
buňky a buňky s indukcí genových mutací.
Jestliže je první pokus negativní, má být proveden druhý pokus s buňkami ve stacionární fázi. Jestliže je první pokus pozitivní, je potvrzen dalším vhodným nezávislým experimentem.