1. Metoda
Metoda je replikací OECD TG 475, Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (1997)
1.1. Úvod
Účelem analýzy chromozómových aberací u savců in vivo je zjistit strukturální chromozómové aberace vyvolané testovanou látkou v buňkách kostní dřeně zvířat, obvykle hlodavců (1) (2) (3) (4). Strukturální aberace mohou být dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Nárůst polyploidie může naznačovat, že daná chemická látka je schopna vyvolávat numerické aberace. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, ovšem k aberacím chromozómového typu dochází rovněž. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou příčinou řady genetických chorob u člověka a existují přesvědčivé doklady toho, že chromozómové mutace a příbuzné jevy, jež způsobují změny v onkogenech a tumorsupresorových genech, hrají úlohu při rakovině u člověka a v experimentálních systémech.
K tomuto testu se běžně využívají hlodavci. Cílovou tkání v něm je kostní dřeň, protože se jedná o tkáň vysoce vaskularizovanou, obsahující populaci rychle se dělících buněk, jež se dají snadno izolovat a zpracovat. Jiné živočišné druhy a cílové tkáně se v tomto testu nepoužívají.
Tento test na chromozómové aberace je zvláště důležitý při hodnocení mutagenního rizika, protože umožňuje brát v úvahu faktory metabolismu in vivo, farmakokinetiky a procesů reparace DNA, i když zde mohou být mezi živočišnými druhy a mezi tkáněmi rozdíly. Test in vivo je také vhodný pro další analýzu mutagenního efektu, který byl předtím zjištěn testem in vitro.
Existují-li doklady o tom, že se testovaná látka nebo její reaktivní metabolit do cílové tkáně dostane, není vhodné použití tohoto testu.
1.2 Definice
Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.
Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring)
Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.
Endoreduplikace: proces, kde po S-fázi replikace DNA nepřechází jádro do mitózy, nýbrž začíná další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómys 4, 8, 16, ... chromatidami.
Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.
Mitotický index: poměr buněk v metafázi dělený celkovým počtem buněk v dané populaci buněk; udává stupeň proliferace této populace.
Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.
Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (teda 3n, 4n atd.).
Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty a výměny.
1.3 Princip metody
Zvířata se vhodným způsobem vystaví testované látce a ve vhodnou dobu po působení se usmrtí. Před usmrcením se na ně působí látkou zastavující metafázi (například kolchicinem nebo Colcemidem®). Z buněk kostní dřeně se pak připraví preparáty a v metafázických buňkách se mikroskopicky zjišťují chromozómové aberace.
1.4 Popis metody
1.4.1 Příprava
1.4.1.1 Výběr živočišného druhu
Běžně se používají potkani, myši a čínští křečci, lze ovšem použít i jakýkoli jiný vhodný savčí druh. Používají se běžné laboratorní kmeny mladých zdravých jedinců. Hmotnostní rozdíly by při zahájení studie měly být minimální a u každého pohlaví nemají přesahovat ± 20 % průměrné hmotnosti.
1.4.1.2 Podmínky chovu
Všeobecné podmínky chovu jsou uvedeny ve Všeobecném úvodu v části B, vlhkost by měla být 50 - 60 %.
1.4.1.3 Příprava zvířat
Zdraví mladí dospělí jedinci se náhodně rozdělí do kontrolní a experimentální skupiny. Klece je třeba uspořádat tak, aby se minimalizovaly případné vlivy toho, jak a kde jsou klece umístěny. Zvířata je třeba jednoznačně označit. Po dobu minimálně pěti dní se zvířata aklimatizují v laboratorních podmínkách.
1.4.1.4 Příprava dávek
Je-li testovaná látka v pevném stavu, před podáním zvířatům se rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle nebo vehikulu a případně se zředí. Kapalné testované látky se mohou podávat přímo nebo se před podáváním zředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o stálosti prokazují, že skladování ji neovlivní
1.4.2 Podmínky testu
1.4.2.1 Rozpouštědlo/vehikulum
Rozpouštědlo/vehikulum v používaných dávkách nesmí vyvolávat toxické účinky a nesmí s testovanou látkou chemicky reagovat. Používá-li se ne příliš známé rozpouštědlo, musí být jeho použití podpořeno údaji o kompatibilitě s testovanou látkou. Doporučuje se, aby kde je to možné, bylo na prvním místě použito vodné rozpouštědlo/vehikulum.
1.4.2.2 Kontroly
Do každého testu je třeba pro každé pohlaví zařadit souběžné pozitivní a negativní (rozpouštědlo/vehikulum) kontroly. je třeba zacházet se zvířaty ve všech skupinách stejně.
Pozitivní kontroly by měly vyvolávat strukturální aberace in vivo při dávkách, kdy lze očekávat jejich detekovatelné zvýšení nad spontánní úroveň. Dávky při pozitivní kontrole se volí tak, aby byly účinky patrné, ale přitom nenapovídaly hodnotiteli totožnost zakódovaného preparátu. Pozitivní kontrolu je možné podávat odlišným způsobem než testovanou látku a vzorek odebírat v jednom časovém intervalu. Kde je to možné, je třeba používat pozitivní kontrolu ze stejné chemické skupiny, jako je testovaná látka. Příklady látek vhodných pro pozitivní kontrolu:
+---------------------------+-----------+-----------+
| Látka | CAS | EINECS |
+---------------------------+-----------+-----------+
| ethyl methansulfonát | 62-50-0 | 200-536-7 |
+---------------------------+-----------+-----------+
| ethyl nitrosomočovina | 759-73-9 | 212-072-2 |
+---------------------------+-----------+-----------+
| mitomycin C | 50-07-7 | 200-008-6 |
+---------------------------+-----------+-----------+
| cyklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
| cyklofosfamid monohydrát | 6055-19-2 | |
+---------------------------+-----------+-----------+
| triethylenmelamin | 51-18-3 | 200-083-5 |
+---------------------------+-----------+-----------+
Negativní kontroly ovlivněné rozpouštědlem nebo vehikulem a zpracované stejným způsobem jako experimentální skupiny měly by být zařazeny do všech časových intervalů zpracování, pokud nejsou k dispozici přijatelné historické údaje o frekvenci chromozómových aberací a o interindividuální variabilitě, mezi zvířaty. Aplikuje-li se u negativních kontrol pouze jeden odběr vzorků, je nejvhodnější dobou první interval odběru vzorků. Mimoto je třeba použít i neovlivněných kontrol, ledaže existují historické nebo publikované údaje prokazující, že zvolené rozpouštědlo, nebo vehikulum nevyvolává žádné nepříznivé nebo mutagenní účinky.
1.5 Postup
1.5.1 Počet a pohlaví zvířat
V každé experimentální a kontrolní skupině musí být minimálně pět analyzovatelných jedinců každého pohlaví. Pokud v době, kdy se studie provádí, existují údaje o stejném živočišném druhu a použití stejných způsobů expozice prokazující, že mezi oběma pohlavími nejsou v toxicitě podstatné rozdíly, je testování pouze na jednom pohlaví postačující. tam, kde humánní expozice chemickým látkám může být závislá na pohlaví, jak je tomu například u některých farmaceutických přípravků, provádí se test na zvířatech odpovídajícího pohlaví.
1.5.2 Dávkovací schéma
Testovanou látku je nejvhodnější podávat jednorázově. Pokud se jedná o objemnou dávku, může se k usnadnění aplikace dávka rozdělit, například na dvě dávky za den podané v rozmezí nanejvýše několika hodin. Jiné režimy dávkování musejí být vědecky odůvodněné.
Vzorky se odebírají ve dvou různých časových intervalech po podání téhož dne. U hlodavců je první interval odběru vzorků 1,5-násobek normální délky buněčného cyklu (která činí obvykle 12 - 18 hodin) po podání látky. Jelikož doba potřebná pro absorpci a metabolismus testované látky a její vliv na kinetiku buněčného cyklu mohou ovlivnit optimální dobu pro detekci chromozómových aberací, doporučuje se další odběr vzorků po 24 hodinách od prvního odběru. Pokud se v daném dávkovacím režimu látka podává vícekrát než jednou za den, je třeba provést jeden odběr vzorků 1,5-násobkem délky normálního buněčného cyklu po posledním podání látky.
Před usmrcením se zvířatům intraperitoneálně injikuje vhodná dávka Colcemidu® nebo kolchicinu a následně se z nich ve vhodném intervalu odeberou vzorky. U myší je tento interval zhruba 3 - 5 hodin, u čínských křečků zhruba 4 - 5 hodin. Z kostní dřeně se odeberou buňky a zjišťují se v nich chromozómové aberace.
1.5.3 Dávkování
Provádí-li se studie ke zjištění rozpětí toxicity, protože nejsou k dispozici žádné vhodné údaje, je třeba ji provádět v téže laboratoři za použití stejného živočišného druhu, kmene, pohlaví a pokusného režimu, jaké se použijí v hlavní studii (5). Při zjištění toxicity, se používají pro první časový interval odběru vzorků tři dávky tak, aby pokrývaly rozmezí od maximální toxicity k toxicitě nízké nebo nulové. Pro pozdější časový interval odběru vzorků je pak třeba použít jenom nejvyšší dávku. ta je definována jako dávka vyvolávající takové známky toxicity, že při vyšších dávkách ve stejném režimu podávání by účinky byly letální. Látky, jež v nízkých netoxických dávkách vykazují specifickou biologickou aktivitu, jako jsou hormony nebo mitogeny, mohou představovat z těchto kritérií pro stanovení dávek výjimky, jež se vyhodnocují individuálně případ od případu. Nejvyšší dávka může být také definována jako dávka, která vede k určitým známkám toxicity v kostní dřeni (např. pokles mitotického indexu o více než 50 %).
1.5.4 Limitní test
Jestliže test při dávce minimálně 2 000 mg/kg hmotnosti v jedné dávce nebo ve dvou dávkách podaných v jeden den nevyvolává žádné pozorovatelné toxické účinky a jestliže se na základě údajů o látkách s podobnou chemickou strukturou neočekává genotoxicita, nemusí být provedena celá studie za použití tří dávkových úrovní. Pro dlouhodobé studie činí limitní dávka 2 000 mg/kg hmotnosti za den při době trvání do 14 dnů, a 1 000 mg/kg hmotnosti při době trvání delší než 14 dnů. Podle očekávané humánní expozice může být zapotřebí použít v limitním testu vyšší dávkové úrovně.
1.5.5 Aplikace látky
Testovaná látka se obvykle aplikuje buď žaludeční sondou, nebo intraperitoneální injekcí. V odůvodněných případech jsou přijatelné i jiné způsoby expozice. Maximální objem kapaliny, která se dá sondou nebo injekcí najednou vpravit, závisí na velikosti pokusného zvířete a nemá překročit 2 ml/100g hmotnosti; vyšší dávky musí být zdůvodněné. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, jež normálně vykazují při vyšších koncentracích horší účinky, je třeba upravit koncentrace látky tak, aby objem byl ve všech dávkových úrovních stejný a minimalizovala se tak objemová variabilita.
1.5.6 Příprava chromozómů
Okamžitě po usmrcení zvířete se odebere kostní dřeň, působí se na ni hypotonickým roztokem a dřeň se fixuje. Suspenze buněk se nakape na podložní sklo a obarví se.
1.5.7 Analýza
Jakožto míra toxicity se u všech zvířat včetně pozitivních i negativních kontrol stanoví mitotický index pro minimálně 1000 buněk z každého jedince.
Z každého jedince se analyzuje minimálně 100 buněk. Tento počet je možné snížit při vysokém počtu aberací. Všechny preparáty (včetně pozitivních a negativních kontrol) se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož při jejich přípravě dochází často k porušení určitého podílu metafází spojeného se ztrátou chromozómů, musí být počet centromer v hodnocených buňkách 2n ± 2.