1. Metoda
Metoda je replikací OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).
1.1 Úvod
Účelem analýzy chromozómových aberací in vitro je nalézt látky, jež v kulturách savčích buněk způsobují strukturální chromozómové aberace (1) (2) (3). Strukturální aberace jsou dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, dochází však též k aberacím chromozómového typu. Vznik polyplodie může naznačovat, že daná chemická látka je schopna vyvolávat numerické aberace. tato metoda však není navržena k analýze numerických aberací a běžně se k tomuto účelu nepoužívá. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou příčinou řady genetických chorob u člověka a existují přesvědčivé doklady toho, že chromozómové mutace a příbuzné jevy, jež způsobují změny v onkogenech a turmosupresorových genech somatických buněk, hrají úlohu při vzniku rakoviny u člověka a experimentálních zvířat.
Tento test se používá k odhalení možných savčích mutagenů a karcinogenů. Řada chemických látek, které jsou v tomto testu pozitivní, je sice pro savce karcinogenní, není však dostatečná korelace mezi tímto testem a karcinogenitou. tato korelace závisí na druhu látky a existuje stále více dokladů o tom, že existují chemické látky, jejichž karcinogenní vlastnosti se tímto testem nezjistí, protože zřejmě působí jiným mechanismem než přímým poškozením DNA.
K analýze chromozómových aberací in vitro se mohou použít kultury stabilizovaných buněčných linií, buněčných kmenů nebo primární buněčné kultury. Použité buňky jsou vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stability karyotypu, počtu chromozómů, jejich diverzity a četnosti spontánních chromozómových aberací.
Testy in vitro vyžadují obecně exogenní zdroj metabolické aktivace. tento systém metabolické aktivace nedokáže dokonale napodobit podmínky u savců in vivo. Je třeba se vyvarovat podmínek, které by mohly vést k pozitivním výsledkům, jež neodrážejí vnitřní mutagenitu, nýbrž jsou způsobeny změnami pH, osmolality nebo vysokou cytotoxicitou (4) (5).
1.2 Definice
Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.
Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring)
Zlom chromatidy: Jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.
Endoreduplikace: proces, kde po S-fázi replikace DNA nepřechází jádro do mitózy, nýbrž začíná další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómy s 4, 8, 16, ... chromatidami.
Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.
Mitotický index: poměr buněk v metafázi dělený celkovým počtem buněk v dané populaci buněk; udává stupeň proliferace této populace.
Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.
Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (teda 3n, 4n atd.).
Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty a výměny.
1.3 Princip metody
Buněčné kultury se vystaví působení testované látky, a to s metabolickou aktivací a bez ní. Ve stanovených intervalech po expozici buněčné kultury testované látce, se metafáze zastaví například Colcemidem® nebo kolchicinem, buňky se sklidí, obarví se a v metafázických buňkách se mikroskopicky zjišťují chromozómové aberace.
1.4 Popis metody
1.4.1 Příprava
1.4.1.1 Buňky
Je možno použít celou řadu buněčných linií, kmenů nebo primárních buněčných kultur, včetně buněk lidských (například fibroblasty čínského křečka nebo lymfocyty periferní krve člověka nebo jiného savce).
1.4.1.2 Média a kultivační podmínky
K udržování kultur je třeba využívat vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentrace CO2, teplota a vlhkost). U buněčných linií a kmenů je třeba běžným způsobem kontrolovat stabilitu modálního počtu chromozómů a nepřítomnost mykoplasmat v buňkách. V případě kontaminace se buňky nepoužívají. Je třeba znát normální dobu buněčného cyklu a kultivační podmínky.
1.4.1.3 Příprava kultur
Stabilizované buněčné linie a kmeny: buňky se množí ze zásobních kultur vysetím do kultivačního média v takové hustotě, aby kultury nedosáhly konfluentní vrstvy před dobou sklízení a inkubují se při teplotě 37 °C.
Lymfocyty: ke kultivačnímu médiu obsahujícímu mitogen (např. fytohemoglutinin) se přidá buď plná krev s vhodným antikoagulantem (např. heparinem), nebo separované lymfocyty získané od zdravých jedinců a kultivují se při teplotě 37 °C.
1.4.1.4 Metabolická aktivace
Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondrální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indikujícími enzymy jako je Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), nebo směs fenobarbitalu a b-naftoflavonu (10) (11) (12).
Konečná koncentrace mitochondrální frakce v médiu činí obvykle 1 - 10 % v/v.Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná látka. V některých případech je vhodné použít mitochondrální frakci v několika koncentracích.
Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).
1.4.1.5 Příprava testované látky.
Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti..
1.5 Podmínky testu
1.6.Rozpouštědlo
U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9. Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.
1.6.1 Koncentrace
Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.
Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu, například stupně konfluence, počet živých buněk, nebo mitotický index. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.
Je třeba použít minimálně tři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě,musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a Ö10. V době sklízení buněk musí být při nejvyšší koncentraci pozorován signifikantní pokles konfluentního růstu, počtu buněk, nebo mitotického indexu (vždy o více než 50 %). Mitotický index je pouze nepřímou mírou cytotických/cytostatických účinků a je závislý na době uplynulé po expozici testovanou látkou. Je však akceptovatelný pro suspenzní kultury, kde by jiná detekce toxicity byla obtížná a nepraktická. jako doplňující informace je možno použít také údaje o kinetice buněčného dělení, jako je průměrný generační čas; ten ovšem představuje celkový průměr, který ne vždy odhalí existenci v dělení zpožděných subpopulací buněk. A tak i malé prodloužení průměrného generačního času může znamenat značný odklon od vhodné doby sklízení z hlediska optimálního výtěžku aberací.
U relativně necytotoxických látek činí maximální koncentrace testované látky nejnižší z hodnot 5 ml/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M.
U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. V některých případech - například dochází-li k toxickému účinku při koncentracích vyšších než je nejnižší nerozpustná koncentrace - se doporučuje testovat při několika koncentracích s viditelným srážením. Může být užitečné vyhodnotit rozpustnost na počátku a na konci působení, protože se během expozice může rozpustnost změnit v testovacím systému vlivem přítomnosti buněk, séra, S9 apod. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.
1.6.2 Negativní a pozitivní kontroly
Do každého experimentu, ať již s metabolickou aktivací nebo bez ní, je třeba zařadit souběžné pozitivní a negativní kontroly (rozpouštědlo, nebo vehikulum). Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrolou látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku.
Pro pozitivní kontrolu se používá známý klastogen, a to při expozičních úrovních, kde se očekává, že poskytne reprodukovatelný a detekovatelný nárůst aberací nad pozadí, prokazující citlivost testovacího systému.
Koncentrace pro pozitivní kontrolu je třeba zvolit tak, aby účinek byl zřejmý, ale neodhaloval hodnotiteli přímo identitu zakódovaných preparátů. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:
+----------------------+---------------------------+-----------+-----------+
| Metabolická aktivace | Látka | CAS | EINECS |
+----------------------+---------------------------+-----------+-----------+
| Ne | methyl methansulfonát | 66-27-3 | 200-625-0 |
| +---------------------------+-----------+-----------+
| | ethyl methansulfonát | 62-50-0 | 200-536-7 |
| +---------------------------+-----------+-----------+
| | ethyl nitrosomočovina | 759-73-9 | 212-072-2 |
| +---------------------------+-----------+-----------+
| | mitomycin C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| +---------------------------+-----------+-----------+
| | 4-nitrochinolin-N-oxid | 56-57-5 | 200-281-1 |
+----------------------+---------------------------+-----------+-----------+
| Ano | benz[a]pyren | 50-32-8 | 200-028-5 |
| +---------------------------+-----------+-----------+
| | cyklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
| | monohydrát cyklofosfamidu | 6055-19-2 | |
+----------------------+---------------------------+-----------+-----------+
Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.
Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění.
1.6.3 Postup
1.6.3.1 Expozice testovanou látkou
Na proliferující buňky se působí testovanou látkou za přítomnosti i nepřítomnosti metabolického aktivačního systému. Na lymfocyty je třeba začít působit asi 48 hodin po stimulaci mitogenem.
Obvykle se pro každou koncentraci používají dvě kultury; a totéž se doporučuje pro negativní kontroly s rozpouštědlem, nebo vehikulem. Pokud lze na základě historických údajů prokázat, že rozdíly mezi duplicitními kulturami jsou minimální (13) (14), je přijatelné, aby se pro každou koncentraci použila jenom jedna kultura.
V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití uzavřených kultivačních nádob (15).
1.6.3.2 Doba sklizení kultury
V prvním experimentu se buňky vystaví testované látce s metabolickou aktivací i bez ní po dobu 3 - 6 hodin a vzorky se odebírají v čase odpovídajícím zhruba 1,5-násobku normální délky buněčného cyklu od začátku expozice (12). Pokud jsou při použití aktivačního systému i bez něho výsledky negativní, provádí se další experiment bez aktivace, s kontinuální expozicí až do doby ukončení kultivace odpovídají zhruba 1,5-násobku normálního buněčného cyklu. Některé látky se hodnotí snáze při době expozice delší než je 1,5-násobek délky buněčného cyklu. Negativní výsledky s metabolickou aktivací se posuzují případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepokládá za nutné, je třeba toto rozhodnutí zdůvodnit.
1.6.3.3 Příprava chromozómů
Na buněčné kultury se působí Colcemidem® nebo kolchicidem obvykle po dobu 1 - 2 hodin před ukončením kultivace. Každá buněčná kultura se pro přípravu chromozómů zpracovává zvlášť. Příprava chromozómů sestává z ovlivnění buněk hypotonickým roztokem, fixace a obarvení.
1.6.3.4 Analýza
Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozomů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven modulárnímu číslu ± 2. Pro každou koncentraci a kontrolu je třeba hodnotit minimálně 200 dobře rozprostřených metafází, stejnoměrně z obou kultur, pokud byly použity. V případě, že je počet aberací vysoký, může se počet analyzovaných metafází snížit.
I když účelem testu je zjistit strukturální chromozómové aberace, je také důležité zaznamenat případnou polyploidii a endoreduplikaci..