VI.1.6.3 Sloupcová eluční metoda
VI.1.6.3.1 Nosič, rozpouštědlo a eluent
Nosič pro sloupcovou eluční metodu by měl být inertní. Vhodnými materiály, které lze použít, jsou skleněné kuličky a píšek. K nanesení zkušební látky na nosič by mělo být použito vhodné těkavé analyticky čisté rozpouštědlo. Jako eluent by měla být použita voda redestilovaná ve skleněné nebo křemenné aparatuře.
Poznámka:
Nesmí se použít voda získaná přímo z organického měniče iontů.
VI.1.6.3.2 Nanášení na nosič
Odváží se přibližně 600 mg nosiče a převede se do 50ml baňky s kulatým dnem.
Přiměřené odvážené množství zkušební látky se rozpustí ve zvoleném rozpouštědle. Dostatečný podíl tohoto roztoku se přidá k nosiči. Rozpouštědlo musí být dokonale odpařeno, např. v rotační odparce, jinak se nedosáhne úplného nasycení nosiče vodou kvůli rozdělovacím efektům na povrchu nosiče.
Nanášení zkušební látky na nosič může být problematické (chybné výsledky), sráží-li se zkušební látka na nosiči jako olej nebo krystalická fáze. Problém by měl být řešen experimentálně a podrobnosti by měly být zaznamenány.
Nosič s nanesenou látkou se nechá 2 h botnat v asi 5 ml vody a suspense se poté naplní do mikrokolony. Je také možné naplnit mikrokolonu, která byla předtím naplněna vodou, suchým nosičem s nanesenou látkou a poté nechat během dvou hodin ustavit rovnováhu.
Zkušební postup:
Vymývání látky z nosiče lze provádět dvěma různými způsoby:
- oběhovým čerpadlem (viz obrázek 1),
- vyrovnávací nádobou (viz obrázek 4).
VI.1.6.3.3 Vymývání kolony použitím oběhového čerpadla
Aparatura
Schematické uspořádání typického systému je znázorněno na obrázku 1. Vhodná mikrokolona je znázorněna na obrázku 2, přijatelná je ovšem i kterákoli jiná velikost za předpokladu, že budou splněna kritéria opakovatelnosti a citlivosti. Prostor hlavy kolony by měl mít obsah nejméně pěti objemů sloupce a měl by být schopný pojmout nejméně pět vzorků. Prostor hlavy kolony může být menší, pokud se počátečních pět objemů sloupce eluovaných s nečistotami nahradí čistým rozpouštědlem.
Kolona by měla být připojena k oběhovému čerpadlu, které zajišťuje konstantní průtok asi 25 ml.h-1. Čerpadlo se připojí hadičkami z polytetrafluorethylenu (PTFE), a/nebo skleněnými trubičkami. U aparatury složené z kolony a čerpadla musí být možnost odběru eluátu a vyrovnávání tlaku v hlavě kolony s atmosférickým tlakem. Materiál v koloně se fixuje malým (5 mm) smotkem skelné vaty, který současně slouží k odfiltrování částeček. Lze použít např. peristaltické nebo membránové čerpadlo (přitom je třeba dbát na to, aby nedošlo ke znečištění materiálem hadičky a/nebo aby nedošlo, k absorpci tímto materiálem).
Postup měření
Zahájí se vymývání kolony. Doporučuje se průtok asi 25 ml.h-1 (to odpovídá u popsané kolony desetinásobku objemu sloupce za hodinu). Nejméně prvních pět objemů sloupce obsahujících nečistoty rozpustné ve vodě se odstraní. Poté se nechá běžet oběhové čerpadlo až do ustavení rovnováhy, které je dosaženo, neliší-li se koncentrace pěti po sobě následujících vzorků při náhodném výběru o více než ± 30 %, přičemž rozdíly jsou nepravidelné. Tyto vzorky by se měly odebírat v intervalech, během kterých kolonou projde objem eluentu rovný nejméně desetinásobku objemu sloupce.
VI.1.6.3.4 Vymývání kolony pomocí vyrovnávací nádoby
Aparatura (viz obrázek 3 a 4)
Vyrovnávací nádoba: je připojena zabroušeným spojem, který je spojen hadičkou z PTFE. Doporučuje se použít rychlost průtoku přibližně 25 ml.h-1. Podíly eluátu následující po sobě se shromažďují a jejich koncentrace se analyzují zvolenou metodou.
Postup měření:
Pro stanovení rozpustnosti ve vodě se použijí prostřední podíly eluátu, ve kterých zůstávají koncentrace nejméně v pěti po sobě jdoucích vzorcích konstantní (± 30 %).
V obou případech (při použití oběhového čerpadla nebo vyrovnávací nádoby) se druhé promýtí provede při poloviční průtokové rychlosti. Shodují-li se výsledky obou pokusů, považuje se výsledek za uspokojivý; je-li zdánlivá rozpustnost při nižší průtokové rychlosti vyšší, je nutné průtok snižovat vždy na polovinu tak dlouho, dokud dva po sobě následující měření neposkytnou stejnou hodnotu rozpustnosti.
V obou případech (v případě oběhového čerpadla nebo vyrovnávací nádoby) je nutné vzorky podrobit zkoušce na koloidní částice pomocí Tyridallova jevu (rozptylem světla). Přítomností takových částic je výsledek znehodnocen a zkouška by měla být opakována po zlepšení filtrační funkce kolony.
Mělo by být zaznamenáno pH každého vzorku. Druhé měření je třeba provést při stejné teplotě.