I.1.6.5 Zkušební postup
Před vlastní zkouškou může být provedena předběžná zkouška s cílem získat informace o rozsahu koncentrací, které mají být použity v hlavní zkoušce.
Kromě sérií zkoušek se provede kontrolní zkouška bez zkušební látky a podle potřeby kontrolní zkouška s pomocnou látkou.
V závislosti na fyzikálních a chemických vlastnostech zkušební látky se zvolí statická, semistatická nebo průtoková zkouška, aby byla splněna kritéria jakosti.
Ryby se exponují zkušební látce za níže uvedených podmínek:
- délka expozice: 96 h;
- počet ryb: nejméně 7 na každou koncentraci;
- nádrže: vhodný objem vzhledem k doporučené obsádce;
- obsádka: pro statickou a semistatickou zkoušku se doporučuje 1,0 g na litr; v průtokovém systému je přijatelná vyšší obsádka;
- zkušební koncentrace: nejméně pět koncentrací, které jsou odstupňovány faktorem nepřevyšujícím 2,2 a které pokrývají rozsah mortality od 0 % do 100 %;
- voda: viz 1.6.1.2;
- osvětlení: osvětlení 12 až 16 h denně;
- teplota: podle druhu ryb (doplněk 2), avšak v rámci dané zkoušky kolísající v toleranci ± 1 °C;
- koncentrace rozpuštěného kyslíku: ne nižší než 60 % hodnoty nasycení vzdušným kyslíkem při dané teplotě;
- krmení: žádné.
Ryby se kontrolují po prvních 2 až 4 h a dále nejméně každých 24 h. Ryby se považují za mrtvé, jestliže při dotyku ocasní ploutve nedochází k žádné reakci a nejsou-li patrné žádné dýchací pohyby. Mrtvé ryby se odstraní, jakmile jsou zpozorovány, a úhyn se zaznamená.
Zaznamenají se všechny zjevné abnormality (např. ztráta rovnováhy, změny v plavání, chování, v dýchací funkci, v pigmentaci atd.).
Měření pH, obsahu rozpuštěného kyslíku a teploty se provádí denně.
Limitní zkouška
S využitím postupů popsaných v této metodě může být provedena limitní zkouška s koncentrací
-1
100 mg.l
s cílem prokázat, že
LC
50
je vyšší než tato koncentrace.
Je-li povaha zkušební látky taková, že ve vodě nelze dosáhnout koncentrace
-1
100 mg.l ,
provede se limitní zkouška při koncentraci odpovídající rozpustnosti této látky v použitém médiu (nebo při maximální koncentraci, kdy látka vytváří stabilní disperzi) (viz také bod 1.6.1.1).
Limitní zkouška se provede se 7 až 10 rybami a se stejným počtem ryb v kontrole (kontrolách). (Podle teorie binomického rozdělení je při použití 10 ryb a při nulové mortalitě 99,9 % pravděpodobnost, že je
LC -1
50 větší než 100 mg.l .
Při 7, 8 nebo 9 rybách znamená nulová mortalita nejméně 99 % pravděpodobnost, že je
LC
50
větší než koncentrace použitá v limitní zkoušce.)
Dojde-li k úhynům, musí se provést celá studie. Jsou-li pozorovány subletální účinky, zaznamenají se.