1. Zkoušení na cílových zvířatech
1.1. Toxikologické zkoušení
Testy tolerance se provádějí tak, že se zkouší biologické, toxikologické a histologické účinky zkoušené doplňkové látky, premixu nebo krmiva. Určuje se faktor bezpečnosti, což je rozdíl mezi navrhovaným nejvyšším dávkováním a dávkou, při které nastupují škodlivé efekty. Je-li zjištěno, že dávka se škodlivými následky leží daleko za hranicemi navrhovaného nejvyššího dávkování, tento koeficient se stanovuje velmi nízký nebo postačí jen řádné určení.
1.2. Mikrobiologické zkoušení
1.2.1. Je-li účinná látka chemicky specifikovatelná a vykazuje-li antimikrobiální aktivitu v koncentrovaných krmivech, provádí se studie na stanovení antimikrobiálního spektra účinnosti účinné látky při určení minimální inhibiční koncentrace u různých patogenních a nepatogenních grampozitivních a gramnegativních druhů bakterií.
1.2.2. Zkoušení k určení křížové rezistence proti léčebným antibiotikům stanovením minimální koncentrace inhibitorů na mutantech produkovaných in vitro a chromozomálně rezistentních na doplňkovou látku.
V případě mikroorganismů rezistentních k léčebným antibiotikům se určuje genetický základ této rezistence.
1.2.3. Zkoušky ke stanovení schopnosti doplňkové látky obsahovat rezistenční selekční faktor. Tyto zkoušky se provádí za provozních podmínek na tom druhu zvířat, pro který je doplňková látka určena. Poté se zkouší, zda nesou nalezené rezistenční selekční faktory vícenásobnou rezistenci a zda jsou přenosné.
1.2.4. Zkoušky ke stanovení působení doplňkové látky:
- na normální střevní floru,
- na kolonizaci trávicího traktu, jedná-li se o mikroorganismy nebo směs některých rodů mikroorganismů,
- na vylučování exkrecí pathogenních mikroorganismů, je-li látka chemicky specifikovatelná a má antimikrobiální aktivitu.
1.2.5. V případě, že doplňková látka vykazuje antimikrobiální aktivitu: zkoušky ke stanovení procentuálního podílu bakterií rezistentních na doplňkovou látku v běžných podmínkách. Tato zkoušení se provádí ve větších časových odstupech před, během a 1 měsíc po nasazení doplňkové látky.
1.2.6. Je-li účinná látka mikroorganismus, určuje se, zda je rezistentní na antibiotika.
1.2.7. Je-li účinná látka vyráběna z mikroorganismů (např. enzymové preparáty) určuje se úroveň jednotlivých životaschopných mikroorganismů.
1.2.8. Jedná-li se o mikroorganismy, předkládají se tyto informace:
- o použití geneticky modifikovatelných mikroorganismů ve výzkumu,
- kompletní technická dokumentace o užití včetně dopadu na ekosystém, rizik pro zdraví lidí a zvířat,
- podmínky pro uvedení do oběhu, včetně označování a balení.
1.3. Zkoušení a stanovení látkové výměny a reziduí účinné látky
1.3.1. Zkoušení bilanční látkové výměny. Vyloučená dávka účinné látky v moči a výkalech, vyloučená dechem, rezidua v organismu.
1.3.2. Zjišťování látkové výměny: absorpce, rozdělení, biotransformace, vylučování. Eventuálně údaje o vylučování žluči z hepatoenterálního cyklu a ze zažívacího traktu.
1.3.3. Analytické stanovení reziduí: kvalitativní a kvantitativní složení reziduí (účinná látka, metabolity) v různých orgánech a tkáních zvířat, rovněž tak ve vyprodukovaných živočišných produktech po vyrovnání látkové výměny a za praktických podmínek užití doplňkové látky.
1.3.4. Farmako - kinetická zkoušení reziduí (po opakovaném podávání doplňkové látky za navržených podmínek používání), persistence účinné látky a hlavních metabolitů v různých orgánech a tkáních po vysazení krmiva obsahujícího doplňkovou látku.
1.3.5. Zkoušení biologické pohotovosti reziduí ve tkáních a produktech cílových druhů zvířat (viz 3.8.).
1.3.6. Metody kontroly: popis kvalitativních a kvantitativních metod použitých pro stanovení v bodech 1.3.1. až 1.3.5. s údaji o použité dávce, specifitě a důkazové cestě. Metody k důkazu reziduí musí být tak přesné, aby byla dokazatelná taková množství reziduí, která jsou toxikologicky nezávadná.